|
|
Determination of proteinogenic amino acids by high-performance separation techniques
Hodek, Ondřej ; Křížek, Tomáš (vedoucí práce) ; Pacáková, Věra (oponent) ; Tůma, Petr (oponent)
(CZ) Proteinogenní aminokyseliny patří mezi základní stavební jednotky živých organismů. Proto byl v poslední době výzkum v metabolomice zaměřen na vývoj rychlých a citlivých analytických metod pro stanovení aminokyselin. Tato práce obsahuje dvě studie popisující vývoj vysoce účinných separačních metod pro kvantifikaci aminokyselin. V první studii byla vyvinuta metoda kapilární elektroforézy pro stanovení aminokyselin v rostlinách tabáku. Nedílnou součástí této studie byla optimalizace extrakce aminokyselin z rostlinného materiálu. Extrakce byla optimalizována postupem "design of experiments" (DoE), pomocí kterého byly vyhodnoceny faktory ovlivňující výtěžek extrakce aminokyselin. Nejdůležitějšími faktory byly objem a koncentrace extrakčního činidla (kyselina chlorovodíková), jejichž optimální hodnoty byly určeny pomocí "response surface methodology" (RSM). Poté byly aminokyseliny separovány pomocí kapilární elektroforézy s bezkontaktní vodivostní detekcí a stanoveny za použití kalibrace s vnitřním standardem, což přispělo ke zlepšení přesnosti metody. Druhá studie byla zaměřena na vývoj metody pro stanovení aminokyselin v lidské plasmě pomocí superkritické fluidní chromatografie. Jedním z cílů této studie bylo zvýšit rozpustnost aminokyselin v mobilní fázi bohaté na CO2. Nejdříve byla zvýšena...
|
|
|
Použití statistického přístupu pro vývoj HPLC metod
Vymyslický, Filip ; Křížek, Tomáš (vedoucí práce) ; Kozlík, Petr (oponent)
Cílem této diplomové práce byl vývoj systematického postupu pro vývoj HPLC metod pomocí statistického přístupu design of experiments. Systém byl vyvinut na základě vývoje tří HPLC metod na stanovení čistoty účinných látek. Pri vývoji systematického potupu pro vývoj HPLC metod pomocí statistického přístupu byla jako první vybrána HPLC metoda stanovení čistoty esomeprazolu. Pomocí přístupu design of experiments byl prozkoumán experimentální prostor v okolí metody za účelem nalézt vhodnější nastavení podmínek separace. Druhou metodou použitou pro vytvoření systému byla metoda stanovení čistoty bisoprololu. Metoda byla převedena na kolonu menších rozměrů a bylo upraveno složení vodné složky mobilní fáze oproti původní lékopisné metodě. Pomocí přístupu design of experiments byl prozkoumán experimentální prostor za účelem nalezení vhodnějších podmínek separace. Poslední byla zvolena metoda na stanovení čistoty risperidonu. Oproti původní lékopisné metodě byla změněna vodná složka mobilní fáze. Byl prozkoumán experimentální prostor v okolí metody přístupem design of experiments s cílem nalézt nejvhodnější podmínky separace. Pro všechny studované HPLC metody byly hodnoty sledovaných chromatografických parametrů získány průzkumem experimentálního prostoru a poté statisticky zpracovány metodou nejmenších...
|
|
|
Determination of low-molecular-mass heparin using affinity capillary electrophoresis
Molnárová, Katarína ; Křížek, Tomáš (vedoucí práce) ; Sobotníková, Jana (oponent)
Štandardný heparín, klinický antikoagulant, je v praxi čoraz častejšie nahradený nízkomolekulárnymi heparínmi. Tie sa používajú kvôli lepším biologickým vlastnostiam, medzi ktoré patrí lepšie predvídateľný antikoagulačný účinok, menej krvácavých komplikácií a lepšia biologická dostupnosť. Hladina nízkomolekulárnych heparínov v krvi je zvyčajne stanovená anti-Xa testom. Toto stanovenie však naráža na isté nedostatky. Táto práca sa venuje stanoveniu nízkomolekulárneho heparínu, Fraxiparínu, pomocou afinitnej kapilárnej elektroforézy. Pretože heparíny sú polysacharidy, ktoré významne neabsorbujú v UV oblasti, ich priama detekcia je náročná. Z toho dôvodu v rámci tejto práce bola použitá nepriama detekcia Fraxiparínu, pričom bola využitá jeho schopnosť tvoriť komplex s protamínom - antidotum heparínu. Protamín je pozitívne nabitý peptid, ktorý má zložitú štruktúru, jeho hlavnou zložkou je však arginín. Z toho dôvodu bol, z účelu stanovenia Fraxiparínu, protamín nahradený tetraarginínom, ktorý má dobre definovanú štruktúru. Základným elektrolytom bola kyselina fosforečná s koncentráciou 9 mmol l-1 s prídavkom 0,1% (w/v) hydroxyetylcelulózy. Základné experimentálne usporiadanie používalo zónové dávkovanie, pričom jednotlivé zóny boli nadávkované tlakom 5 kPa. Ako prvá bola nadávkovaná zóna Fraxiparínu,...
|
|
|
Separace látek tvořících kapalné krystaly pomocí bezvodé kapilární elektrokinetické chromatografie
Čokrtová, Kateřina ; Křížek, Tomáš (vedoucí práce) ; Kubíčková, Anna (oponent)
Kapalné krystaly jsou látky široce využívané v elektronice, lékařství a dalších oborech. Analytické separace jsou důležité v oblasti vývoje nových kapalných krystalů pro kontrolu čistoty syntetizovaných látek. Analýza vzorku je důležitá pro zjištění přítomnosti nečistot pocházejících ze syntézy i pro zjištění chirální čistoty látky. Látky tvořící kapalné krystaly neobsahují snadno ionizovatelné funkční skupiny, což vylučuje jejich separaci v kapilární zónové elektroforéze. Elektrokinetická chromatografie je metoda, při které se do základního elektrolytu přidává vhodný surfaktant. Látky bez náboje pak interakcí s elektricky nabitým surfaktantem získávají efektivní náboj, čímž může docházet k separaci, pokud s přidaným surfaktantem interagují rozdílně. Dalším problémem komplikujícím analýzu je velmi nízká rozpustnost analytů ve vodě. Separace v této práci byly proto prováděny v bezvodém prostředí acetonitrilu. Za zmíněných podmínek však byla pozorována nízká opakovatelnost migračních časů látek. Proto byly při následných měřeních využívány kapiláry s různě pokrytou vnitřní stěnou. Úpravou povrchu by mělo dojít ke zlepšení opakovatelnosti migračních časů. Bylo testováno několik druhů pokrytí kapiláry. Nejprve bylo testováno dynamické pokrytí, kdy byla kapilára před sérií měření promyta vodným roztokem...
|
|
|
Vliv druhu iontů separačního elektrolytu na stabilitu základní linie v kapilární elektroforéze
Kolečkářová, Tereza ; Křížek, Tomáš (vedoucí práce) ; Kubíčková, Anna (oponent)
V této práci je studován jev nestability základní linie elektroferogramu při použití draselného pufru jako základního elektrolytu, který byl zjištěn při studii elektroferotických mobilit markerů elektroosmotického toku v různých separačních pufrech [1]. Tento jev znesnadňuje vyhodnocení výsledků při vyšších koncentracích pufru. Cílem je zjistit, jestli je tento jev specifický pro draselné ionty nebo se týká i jiných iontů a v tom případě za jakých podmínek. Míra nestability základní linie signálu je sledována jako její směrodatná odchylka a je porovnávána pro draselný, sodný, amonný a lithný pufr. Pro draselný a sodný pufr je nejprve nestabilita signálu zkoumána při aplikaci vysokého napětí a tlaku na systém v různých časových intervalech. Je prokázáno, že větší nestabilita základní linie je v draselném pufru způsobena aplikací vysokého napětí. Poté je nestabilita signálu porovnávána při různých hodnotách aplikovaného napětí a je demonstrován pravděpodobný vliv Joulova tepla. U všech zkoumaných kationtů bylo pozorováno snížení stability základní linie signálu s rostoucí iontovou silou a konduktivitou, nejedná se tedy o jev výlučně spojený s draselnými ionty. Přesto je v pufru s draselným kationtem, ač nemá nejvyšší vodivost, nestabilita signálu největší. Míra nestability základní linie signálu...
|
|
|
Studium (bio)molekulových interakcí a enzymových reakcí kapilárními elektroforetickými metodami
Růžička, Martin ; Hudeček, Jiří (vedoucí práce) ; Mikšík, Ivan (oponent) ; Křížek, Tomáš (oponent)
Nekovalentní interakce se podílejí na většině procesů v živých organismech. Sílu interakce mezi (bio)molekulami lze charakterizovat pomocí vazebné konstanty příslušných komplexů, k jejímuž stanovení je možno využít řadu fyzikálně-chemických metod. Z nich metody kapilární elektroforézy disponují několika přednostmi: (1) interakce probíhají mezi volnými molekulami ve vodném roztoku bez nutnosti jejich immobilizace, (2) krátká doba analýzy, (3) velmi malá spotřeba zkoumaných molekul, a (4) snadná automatizace analýz. V rámci této disertační práce byly vyvinuty metody afinitní kapilární elektroforézy s částečným plněním (PF-ACE) pro zkoumání interakce mezi oligonukleotidy dvouvláknové DNA a dobře charakterizovaným interkalátorem ethidium bromidem jako modelovou sloučeninou. Následně byly v těchto podmínkách stanoveny vazebné konstanty komplexů oligofenylenových derivátů s DNA oligonukleotidy. Metoda PF-ACE byla optimalizována pro sledování enantioselektivních interakcí mezi helquaty a vybranými chirálními kyselými aromatickými analyty. Bylo identifikováno několik látek, jejich enantiomery byly pomocí helquatů jakožto chirálních selektorů odděleny. Kapilární elektroforéza byla použita jako separační analytická metoda při sledování štěpení peptidových substrátů rhomboidními proteasami. Metoda byla...
|
|
|
Chromatographic characterization of polyaniline-coated stationary phases
Taraba, Lukáš ; Křížek, Tomáš (vedoucí práce) ; Pacáková, Věra (oponent) ; Srbek, Jan (oponent)
(CZ) Tato dizertační práce se zabývá fyzikálně-chemickou charakterizací stacionárních fází potažených polyanilinem. V první části byly chemickou polymerizací anilinium(1+) chloridu in-situ modifikovány povrchy sorbentů na bázi čistého silikagelu a silikagelu s navázanou oktadecylovou skupinou. Jejich následná systematická charakterizace byla provedena s použitím modelu lineárních vztahů solvatačních energií v HILIC módu kapilární kapalinové chromatografie. Dále bylo k popisu vlastností modifikovaných materiálů použito několik běžných fyzikálně-chemických technik. Modifikované sorbenty byly ve formě suspenzí naplněny do kapilárních kolon. Retenční interakce probíhající mezi analytem a separačním systémem byly zhodnoceny na základě retenčních dat pro množství různých analytů. Výsledky ukázaly, že polyanilinový povlak měl významný vliv na retenci podporující interakce pro obě stacionární fáze. Předpokládaný smíšený retenční mechanismus byl prokázán pro obě stacionární fáze. Druhá část se zabývá zkoumáním separačního potenciálu stacionární fáze potažené polyanilinem v různých chromatografických módech. Pro strukturně podobné látky byly zkonstruovány křivky retenčních faktorů závislé na podílu organického modifikátoru v mobilní fázi. Získané výsledky ukázaly, že tato stacionární fáze je použitelná ve...
|
|
|
Chromatografická charakterizace iontově výměnné kolony
Seidlová, Bára ; Sobotníková, Jana (vedoucí práce) ; Křížek, Tomáš (oponent)
Při charakterizaci zvolené iontově výměnné kolony Phenosphere™ SCX byl zvolen následující postup. Nejdříve byla vybrána sada biologicky zajímavých analytů, která obsahovala několik bazických léčiv; konkrétně pět tricyklických antidepresiv (TCA), anestetikum prokain a látku s antimalarickým a antiarytmickým účinkem - chinidin. Pro tuto řadu bazických látek byly optimalizovány separační podmínky na charakterizované iontově výměnné koloně Phenosphere™ SCX. Byl studován vliv složení mobilní fáze, tedy vliv použitého pufru a jeho koncentrace, pH pufru a vliv přídavku organického modifikátoru (v tomto případě methanolu) na chromatografické chování vybraných léčiv. Za optimalizovaných chromatografických podmínek pro analýzu bazických léčiv pak byla iontově výměnná kolona charakterizována pomocí metody LSER (model lineárních vztahů solvatační energie). Bylo zjištěno chromatografické chování sady testovacích látek se známými hodnotami molekulárních deskriptorů a následně provedena vícenásobná lineární regrese mezi retenčními faktory testovacích látek a jejich molekulárními deskriptory. Výsledky vícenásobné lineární regrese byly diskutovány a poté byly vyhodnoceny interakce přispívající k retenci analytů na studované kationtově výměnné koloně Phenosphere™ SCX. Klíčová slova: HPLC, iontově výměnná...
|
|
|
Studie vlivu protaminu na nepřímé elektroforetické stanovení heparinu
Petrák, Ondřej ; Křížek, Tomáš (vedoucí práce) ; Kubíčková, Anna (oponent)
Cílem této bakalářské práce bylo studium interakcí heparinu a protaminu v prostředí kapilární zónové elektroforézy pomocí jejich vlivu na velikost plochy píku tetraargininu. Byla použita křemenná kapilára o vnitřním průměru 50 µm a celkové délce 50 cm. Efektivní délka kapiláry byla 41,5 cm a vzorek byl dávkován na dlouhý konec kapiláry. Byl optimalizován způsob dávkování jednotlivých zón, vhodné složení základního elektrolytu bylo již známo z předešlých experimentů, na které tato práce navazovala. Základní elektrolyt byl složen z 0,1 M roztoku kyseliny trihydrogenfosforečné a 0,1% roztoku hydroxyethylcelulózy. Vzorek byl dávkován hydrodynamicky tlakem 5,0 kPa po dobu 120 s. Následně byla stejným tlakem po dobu 90 s dávkována zóna základního elektrolytu. Poslední dávkovanou zónou byla zóna tetraargininu o koncentraci 1 mg/ml, která byla dávkována hydrodynamicky tlakem 5,0 kPa po dobu 3 s. Posledním krokem bylo vložení separačního napětí 30 kV po dobu 30 s. Tetraarginin byl detegován při λ = 200 nm. Byly změřeny vlivy samotného heparinu/ protaminu a jejich směsí v různých vzájemných poměrech. Bylo ověřeno, že se zvyšující se koncentrací heparinu dochází k poklesu plochy píku tetraargininu. Nově bylo zjištěno, jaký vliv na velikost tohoto účinku má přítomnost protaminu. Zde došlo k překvapivému...
|
|
|
Vývoj metody UHPLC pro studium stability venetoclaxu
Máchalová, Jitka ; Křížek, Tomáš (vedoucí práce) ; Kozlík, Petr (oponent)
Tato práce se zabývá vývojem chromatografické metody pro stanovení venetoclaxu a kontrolu jeho čistoty pomocí techniky UHPLC. Venetoclax je nízkomolekulární inhi- bitor antiapoptického proteinu Bcl-2, který hraje důležitou roli při regulaci apoptózy a při vzniku hematologické malignace. Venetoclax se tedy používá pro léčbu chronické lymfocytární leukemie. Kvůli problematické rozpustnosti analytu byl jako rozpouště- dlo vzorku zvolen 10mM vodný roztok H3PO4 : ACN s 40% objemovým zastoupením acetonitrilu. Dále byla nalezena optimální kombinace stacionární a mobilní fáze. Optimalizace byla prováděna především s ohledem na faktor chvostování píku vene- toclaxu a jeho rozlišení od nečistoty eluující v jeho těsné blízkosti. V optimalizované metodě byla použita kolona Acquity UPLC BEH Phenyl (100 × 2,10 mm; 1,7 µm) a jako mobilní fáze směs pufru (10mM H3PO4/NH3 o pH 2,5) s přídavkem 0,5% trifluoroctové kyseliny a ACN. Součástí validace metody bylo testování přesnosti, opa- kovatelnosti, meze detekce a kvantifikace, linearity a lineárního dynamického rozsahu, robustnosti metody a testování stability vzorku. Opakovatelnost retenčního času byla 0,07 % a opakovatelnost plochy píku byla 0,45 %. Hodnota meze detekce metody byla 1,6 · 10−5 mg mm−1 a hodnota meze kvantifikace byla 5,4 · 10−5 mg mm−1 . Linearita...
|
host ::
RSS.