|
|
Využití magnetických mikročástic pro izolaci bakteriální DNA
Hrudíková, Radka ; Horák, Daniel (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
Práce byla zaměřena na testování dvou typů magnetických mikročástic funkcionalizovaných –COOH skupinami pro izolaci bakteriální DNA. Izolace byla provedena z hrubých lyzátů buněk připravených z čisté kultury Lactobacillus paracassei RL-10, v prostředí 2 M NaCl a 16% PEG 6000. Dále byl sledován vliv degradace RNA enzymem RNasa A na množství izolované DNA. Bylo zjištěno, že degradace RNA v hrubých lyzátech buněk měla vliv na množství izolované DNA. Množství izolované DNA záleželo na použitých mikročásticích. Větší množství DNA bylo izolováno pomocí částic s větším obsahem –COOH skupin. Nosiči byla izolována DNA amplifikovatelná v PCR. V další části práce byly testovány nosiče funkcionalizované –NH2 skupinami při izolaci DNA s využitím elektrostatických sil. Bylo prokázáno, že pro vazbu DNA na nosič je vhodné prostředí s nižším pH.
|
|
|
Izolace bakteriální DNA z potravin s využitím magnetických nosičů
Bubeníková, Lucia ; Horák, Daniel (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
Práce byla zaměřena na selektivní izolaci bakteriální DNA pomocí magnetických nosičů se streptavidinem (PGMA-NH2-STV, MPG® Streptavidin). Byly optimalizovány podmínky funkcionalizace nosičů dvěma biotinylovanými sondami: množství nosiče, množství sondy, vazba biotinylové sondy na streptavidin. Pro hybridizaci byla použita purifikovaná DNA Lactobacillus. Byla testována vazba DNA na sondu (DNA/DNA hybridizace) a nespecifická vazba DNA na částice. Cílová DNA, eluovaná z nosiče, byla identifikována pomocí PCR s primery R16-1 a LbLMA1-rev a s primery P_eub a F_eub. Množství sondy navázané na nosič bylo stanoveno spektrofotometricky. Bylo zjištěno, že k funkcionalizaci lze použít biotinylovanou sondu o koncentraci 5 pmol/µl, přidávanou k nosiči v poměru nosič:sonda 1:1. Bylo ukázáno, že nespecifická adsorpce DNA na nosič MPG® Streptavidin je výrazně menší než na nosič PGMA-NH2-STV. DNA/DNA hybridizací s využitím nosiče MPG® Streptavidin byla izolována DNA z čisté kultury Lactobacillus. Postup byl aplikován na izolaci DNA z mléčných výrobků.
|
|
|
Izolace DNA z probiotických výrobků s využitím pevných nosičů
Bonczek, Ondřej ; Horák, Daniel (oponent) ; Rittich, Bohuslav (vedoucí práce)
Mikrobiální DNA byla izolována z hrubých lyzátů buněk rodu Lactobacillus a z probiotických výrobků. Bylo využito reverzibilní adsorpce DNA na neporézní magnetické částice poly(2-hydroxyethyl methacrylát-co-glycidyl methacrylát) - P(HEMA-co-GMA) pokryté karboxylovými skupinami a nanočástice manganatého Perovskitu, pokrytého silikagelem. DNA byla adsorbována na povrch částic v prostředí 16% PEG 6000 a 2M NaCl. Adsorbovaná DNA byla z částic uvolněna v nízkoiontovém TE pufru (pH= 8,0). Kvalita a koncentrace izolované DNA byla ověřena spektrofotometricky a amplifikací v PCR. Vzorky DNA izolované magnetickými částicemi a metodou fenolové extrakce (kontrola) byly amplifikovány v PCR. DNA izolovaná z hrubých lyzátů buněk probiotických výrobků byla kvantifikována s využitím kvantitativní PCR v reálném čase.
|
|
|
Identification of probiotic Bifidobacterium strains in dairy products
Zovčáková, Monika ; Horák, Daniel (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
Lactobacilli are dominant bacteria of the vaginal flora. Lactobacillus-containing probiotics products are used for the treatement and profylaxis of bacterial urogenital infections. This work is focused on DNA identification and species identification of probiotic bacteria in 5 different vaginal tablets using molecular-genetic methods. Total DNA isolated from complex matrix of vaginal tablets was used for amplification in polymerase chain reaction. DNA was isolated from crude cell lysates by magnetic particles P(HEMA-co-GMA) and by method of phenol extraction. Identification of species of probiotic bacteria was verified using genus-specific and species-specific PCRs. Results of bacterial identification obtained by PCR were compared with declared specification given by producers. Bacteria of genus Lactobacillus were proved in all tablets whereus species identification was in accordance with the stated composition in 1 tablet only.
|
|
|
Izolace a identifikace DNA probiotických bakterií v komplexních matricích
Balogová, Petra ; Horák, Daniel (oponent) ; Rittich, Bohuslav (vedoucí práce)
V dnešní době jsou hojně využívány v potravinářském průmyslu probiotické bakterie mléčného kvašení (BMK) a bifidobakterie. Tvoří mikroflóru gastrointestinálního traktu. Mohou být do organismu dodávané jako potravinové doplňky. Nejnovější metody identifikace bakterií mléčného kvašení a bifidobakterií jsou založeny na analýze DNA s využitím amplifikačních metod. Nejvíce se využívá polymerázová řetězová reakce (PCR). Cílem diplomové práce bylo využití rodově a druhově specifických PCR pro identifikaci kmenů rodu Lactobacillus a Bifidobacterium v komplexních matricích (6 potravinových doplňků: Zenflo, Linex Forte, Probian, Nutra Bona, GS Laktobacily Forte, Pangamin Bifi Plus). Do PCR směsi byla použita celková DNA izolovaná z tablet pomocí magnetických nosičů pokrytých karboxylovými skupinami. DNA byla izolována z hrubých lyzátů buněk. Při přípravě hrubých lyzátů bylo testováno množství lysozymu (3 mg/ml, 10 mg/ml) v lyzačním roztoku, délka inkubace s lysozymem při laboratorní teplotě (1,5 hod, 3 hod) a s proteinázou K a SDS při 55 °C (1 hod, 3 hod, přes celou noc). Izolovaná DNA byla detekována pomocí agarósové gelové elektroforézy a spektrofotometricky. Přítomnost bakteriální DNA byla ověřena v PCR .K identifikaci byly použity specifické primery pro rod Lactobacillus, Bifidobacterium a druhy Lb. acidophilus, Lb. casei/paracasei, Lb.rRhamnosus, Lb. Plantarum, B. animalis, B. bifidum, B. infantis, B. longum. U třech probiotických preparátů (Zenflo, Linex Forte a Pangamin Bifi Plus) byla prokázána shoda PCR produktů s deklarovanými údaji. U ostatních probiotických tablet (Probian, Nutra Bona, GS Laktobacily Forte) byla shoda jen na úrovni rodů.
|
|
|
Izolace nukleových kyselin pro diagnostické účely s využitím polymerních nosičů
Syslová, Ivona ; Horák, Daniel (oponent) ; Rittich, Bohuslav (vedoucí práce)
V diplomové práci byla studována izolace kyseliny deoxyribonukleové (DNA) pomocí tří různých metod: fenolovou extrakcí, vysolováním chloridem sodným a magnetickou separací využívající reverzibilní adsorpce nukleových kyselin na různé magnetické nosiče. K izolaci DNA bylo využito 5 různých vhodně funkcionalizovaných nosičů: magnetického silikagelu, P(HEMA-co-GMA) ox. I, P(HEMA-co-GMA) ox. II, Dynal DNA Direct a Perovskit 439. K reverzibilní imobilizaci DNA na nosič docházelo v prostředí vysoké koncentrace NaCl a poly(ethylenglykolu) (PEG). Pro návázání DNA na magnetické mikročástice byla navozena kondenzace DNA pomocí 2 M NaCl a PEG o molekulové hmotnosti 6000, kdy výsledná koncentrace PEG v separační směsi byla 8 a 16 %. Cílem bylo získat DNA v kvalitě vhodné pro polymerasovou řetězovou reakci (PCR). DNA byla izolována z bakteriálních kultur tří sbírkových probiotických kmenů, L. amylovorus CCM 4380T, L. zeae CCM 7069 T, L. plantarum CCM 7039T, které byly kultivovány na médiu MRS. DNA byla rovněž izolována z fermentovaných mléčných výrobků: Jihočeský zákys s ovocem jahoda (kysaný mléčný výrobek s probiotickou kulturou Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium lactis a Streptococcus thermophilus), Revital active (bílý jogurt s inulinem a probiotickou kulturou Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus a Bifidobacterium sp.) a Actimel višeň (mléčný výrobek s obsahem probiotické kultury Lactobacillus casei). Po provedení PCR s izolovanou DNA byly PCR produkty detekovány pomocí agarosové gelové elektroforézy. Metodou PCR byla ověřena úspěšnost izolace DNA probiotických bakterií pomocí fenolové extrakce, vysolováním chloridem sodným i magnetickou separací s využitím různých magnetických nosičů. Metoda magnetické separace s využitím magnetických mikročástic byla také ověřena pro izolaci DNA v kvalitě vhodné pro PCR u probiotických kysaných mléčných výrobků.
|
|
| |
|
| |
|
| |
|
| |
host ::
RSS.