|
|
Functional characterization of MDR pump Pdr5p responsible for multiple drug resistance in yeast Saccharomyces cerevisiae
Sayedová, Shirin ; Gášková, Dana (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Jedním z hlavních důvodů selhávání léčby infekcí způsobených patogenními mikroor- ganismy je nadměrná exprese membránových proteinů, které aktivně odstraňují léky z buněk, což vede k fenoménu zvanému mnohočetná léková rezistence MDR. V této práci jsme se zaměřili na funkční charakterizaci MDR pumpy Pdr5p u kvasinky Saccharomyces cerevisiae. Ověřili jsme, že je možné použít dis-C3(3) fluorescenční metodu pro stanovení vazebných míst, do kterých se substráty vážou ve vazebné kapse pumpy ScPdr5p. Zaměřili jsme se na studium vazebné kapsy ScPdr5p pomocí triazolových derivátů: ravukonazolu, vorikonazolu a flukonazolu. Pomocí zónového testu jsme ukázali, že všechny tři studo- vané triazoly jsou substráty pumpy ScPdr5p. Zjistili jsme, že tyto strukturní analogy mají výrazně odlišný vliv na inhibici transportu potenciometrické fluorescenční sondy dis-C3(3) pumpou ScPdr5p, a také, že ravukonazol s vorikonazolem vzájemně kompetují o transport pumpou ScPdr5p. Využili jsme fluorescenční přístup ke studiu vazby azolů do vazebné kapsy pumpy ScPdr5p pomocí benchmark substrátů, které se vážou selek- tivně pouze do jednoho vazebného místa ve vazebné kapse pumpy ScPdr5p, a podpořili jsme tak hypotézu, že ravukonazol a vorikonazol se vážou do více než jednoho vazebného místa. 1
|
|
|
Studium činnosti kvasinkových MDR pump pomocí fluorescenčních sond: účinek potenciálních inhibitorů
Drietomská, Andrea ; Gášková, Dana (vedoucí práce)
Použitím sady piatich izogénnych mutantných kmeňov sme skúmali vplyv sady dvanástich aminoesterov mastných kyselín, patriacich medzi lyzozomotropné fungicidy (LF), na membránový potenciál a aktivitu MDR púmp Pdr5p, Snq2p a Yor1p v bunkách S. cerevisiae pomocou nedávno vyvinutej metódy, ktorá je kombináciou metódy využívajúcej fluorescenčnú sondu diS-C3(3) a biologických testov [1]. V závislosti na chemickej štruktúre a koncentrácii vykazujú LF tieto účinky na bunky: (a) depolarizáciu membrány, (b) interakciu s MDR pumpami a (c) poškodenie membrány vedúce k permeabilizácii buniek. Depolarizácia membrány bola pozorovaná takmer u všetkých LF, zatiaľ čo len tri z testovaných látok interagovali s MDR pumpami, konkrétne šlo o čiastočnú kompetitívnu inhibíciu MDR pumpy(púmp). Zistilo sa, že pomocou vyvíjanej fluorescenčnej diagnostickej metódy možno vylúčiť z kategórie potenciálnych inhibítorov tie látky, ktoré, i keď sú substrátmi púmp Pdr5p a Snq2p, nespĺňajú potrebné kritérium, že už vo veľmi nízkych koncentráciách musia zabrániť transportu sondy z buniek týmito pumpami.
|
|
|
Study of the differences in the architecture of the binding pockets of two major MDR pumps of yeast Saccharomyces cerevisiae, Pdr5p and Snq2p, using their common substrates
Backová, Lenka ; Gášková, Dana (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Mnohonásobná lieková rezistencia (multidrug resistance, MDR) je zodpovedná za po- kles účinnosti liekov na patogénnych mikroorganizmoch alebo nádorových ochoreniach. Jeden z mechanizmov mnohonásobnej liekovej rezistencie je export liekov z bunky pomo- cou membránových transportérov - púmp. Hlavné MDR pumpy kvasinky Saccharomyces cerevisiae sú Pdr5p a Snq2p, ktoré majú vysokú aminokyselinovú sekvenčnú podobnosť. Táto práca sa sústredí na rozdiely týchto púmp, ich väzobné kapsy a ich usporiadanie. Väzobná kapsa pumpy Pdr5p je lepšie preskúmaná, porovnanie výsledkov z merania me- dzi pumpou Pdr5p a Snq2p vedie k rozšíreniu znalosti o väzobnej kapse Snq2p. Pomocou zónového testu určíme spoločné substráty púmp, ketokonazol a bifonazol. Tieto substráty použijeme v meraní pomocou metódy potenciometrickej fluorescenčnej sondy diS-C3(3). Z výsledkov sme zistili, že väzobná kapsa Snq2p má viac väzobných miest. Väzobné kapsy Pdr5p a Snq2p sa navzájom líšia vo väzobných miestach a ich konformá- cii. Avšak konformácia oboch púmp je dynamická, k čomu sme dospeli z výsledkov po pridaní glukózy k bunkám na dodanie energie. 1
|
|
|
Studium transportních systémů mikroorganismů
Jančíková, Iva ; Gášková, Dana (vedoucí práce) ; Amler, Evžen (oponent) ; Krůšek, Jan (oponent)
Název práce: Studium transportních systémů mikroorganismů Autor: Mgr. Iva Jančíková Katedra / Ústav: Fyzikální ústav Univerzity Karlovy Vedoucí disertační práce: doc. RNDr. Dana Gášková, CSc., Fyzikální ústav UK Abstrakt: Nadprodukce transportních proteinů, které aktivně odstraňují cizorodé látky z buněk, je zodpovědná za fenomén nazývaný mnohočetná léková rezistence (MDR). Zjištění, že potenciometrická fluorescenční sonda diS-C3(3) je substrátem hlavních MDR pump u tří druhů kvasinek, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis a Candida albicans, nám umožnilo použít diS-C3(3) fluorescenční metodu pro sledování inhibice činnosti těchto membránových transportérů účinkem různých chemických stresorů (společných substrátů). Z porovnání míry inhibice transportu sondy pumpami ScPdr5p a KlPdr5p vyplynulo odlišné uspořádání jejich vazebné kapsy, které je v případě KlPdr5p těsnější. U kvasinky K. lactis jsme dále zjistili, že zatímco delece genu KlPDR16 neovlivňuje aktivitu KlPdr5p, vede pouze k hyperpolarizaci buněk, delece genu KlERG6 se projeví jak změnou membránového potenciálu, tak potlačením činnosti KlPdr5p. Skutečnost, že sonda je substrátem nejenom dvou hlavních pump ScPdr5p a ScSnq2p u S. cerevisiae, ale také dvou hlavních pump CaCdr1p a CaCdr2p u C. albicans, nám umožnila vyvinout efektivní postup pro...
|
|
|
Characterization of native and heterologously expressed membrane transporters in yeast using fluorescent probes
Zahumenský, Jakub ; Gášková, Dana (vedoucí práce) ; Cebecauer, Marek (oponent) ; Krůšek, Jan (oponent)
Transportéry plasmatické membrány kvasinekhrají důležitou úlohu v mnoha buněčných dějích. Mezi tyto děje patří například detoxikace a budování a udržování membránového potenciálu (ΔΨ). Metoda využívající fluorescenční sondu diS-C3(3) vyvinuta na Oddělení biofyziky Fyzikálního ústavu Univerzity Karlovy nám umožnila pohodlně studovat obojí a je zároveň vhodným nástrojem pro sledování změn těchto důležitých parametrů. Mnohé studie jak na živočišných buňkách, tak i na kvasinkách, ukázali, že etanol a jiné alkoholy inhibují funkci různých membránových kanálů, receptorů a specifických transportérů. Jako mechanismus účinku byla uvažována přímá interakce alkoholů s těmito membránovými proteiny. V naší studii jsme pro identifikaci inhibitorů pump mnohočetné lékové rezistence použili metodu s fluorescenční sondou diS-C3(3) a sadu kvasinkových kmenů s delecí genů PDR5 a SNQ2. Zjistili jsme, že pumpy kódované těmito dvěma geny jsou inhibovány n-alkoholy (od etanolu po hexanol). Ukázali jsme, že inhibiční účinek roste s délkou uhlovodíkového řetězce alkoholů, nesouvisí s poškozením plasmatické membrány a je plně revezibilní. Tyto zjištění napovídají, že studovaný inhibiční účinek nemusí nutně zahrnovat jenom změny lipidové matrice plasmatické membrány, ale může být způsoben také přímou interakcí alkoholů s pumpami....
|
|
|
Studium membránových transportních procesů u kvasinek pomocí potenciometrické fluorescenční sondy diS-C3(3)
Bartl, Tomáš ; Gášková, Dana (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Název práce: Studium membránových transportních procesů u kvasinek pomocí potenciometrické fluorescenční sondy diS-C3(3) Autor: Tomáš Bartl Katedra / Ústav: Fyzikální ústav UK Vedoucí bakalářské práce: doc. RNDr. Dana Gášková, CSc., Fyzikální ústav UK Abstrakt: V membránách kvasinek existuje celá řada transportérů. Některé jsou zodpovědné za přísun živin do buněk, jiné za vylučování odpadních a cizorodých látek ven z buněk nebo za transport malých anorganických iontů a protonů přes membránu. V této práci byla studována činnost specifických transportních proteinů, tzv. MDR pump, které jsou zodpovědné za odstraňování cizorodých látek/léků z buněk. Pomocí série mutantních kmenů kvasinek Saccharomyces cerevisiae (AD12, AD1-3 a AD1-8) lišících se zastoupením jednotlivých MDR pump v jejich plazmatické membráně byl zkoumán vliv různých chemických látek na změnu intracelulární koncentrace potenciometrické fluorescenční sondy diS-C3(3), která je aktivně odstraňována z buněk některými z těchto pump. Sledováním účinku glukózy a 2-deoxyglukózy byl prokázán aktivní příspěvek nejenom hlavní MDR pumpy, Pdr5p, ale také dalších pump ke snižování intracelulární koncentrace sondy. Bylo zjištěno, že zatímco glukóza zvyšuje aktivitu těchto pump při odstraňování sondy z cytosolu, přidání 2-deoxyglukózy způsobuje naopak jejich...
|
|
|
Competition of cells within the population of yeast colony
Očková, Veronika ; Váchová, Libuše (vedoucí práce) ; Gášková, Dana (oponent)
Kompetícia je veľmi významný prírodný jav, pri ktorom dochádza k súpereniu organizmov v prípadoch, ako je obmedzenie priestoru či nedostatok živín. Nastáva hlavne v prípadoch keď organizmy, vrátane mikroorganizmov žijú v početných populáciách. K takýmto populáciám sa radia aj mnohobunkové kvasinkové kolónie, ktoré vytvára Saccharomyces cerevisiae. V okamihu, keď populácia kvasinkových buniek vyčerpá živiny z okolia, sú bunky v kolóniách schopné reagovať na tieto zmeny produkciou signálnych molekúl amoniaku. Vďaka jeho produkcii sú bunky schopné zmeniť svoju morfológiu a metabolizmus a v závislosti na umiestnení v kolónii vytvoriť subpopuláciu buniek so špecifickými vlastnosťami a rozdielnou funkciou. Je pravdepodobné, že v prípade zmiešaných kolónií tvorených dvoma kmeňmi, môže medzi bunkami týchto kmeňov dochádzať ku kompetičnej rivalite, a tým môže dôjsť k zmene pomeru buniek oboch kmeňov v populácii kolónie, takže nakoniec počet buniek jedného kmeňa preváži nad druhým. V tejto práci som porovnávala rast a vývoj gigantických kolónií a kompetíciu medzi bunkami vybraných dvojíc kmeňov tvoriacich takúto zmiešanú kolóniu. Vychádzala som z rodičovského kmeňa kvasinky S. cerevisiae BY a jeho variant značených fluorescenčnými proteínmi. Pre štúdium kompetície medzi rodičovským kmeňom a kmeňom neschopným...
|
|
|
Sledování účinku medicínsky významných léčiv na aktivitu lidského P-glykoproteinu pomocí fluorescenčních sond
Veľas, Lukáš ; Gášková, Dana (vedoucí práce) ; Sigler, Karel (oponent)
Jednou z hlavných príčin zlyhávania liečby rakoviny pomocou chemoterapie je fenomén tzv. mnohonásobnej liekovej rezistencie (multidrug resistance - MDR). Najdôležitejším proteínom sprostredkujúcim MDR v ľudských bunkách je P-glykoproteín. Hlavným cieľom práce bola modifikácia fluorescenčnej metódy, vyvinutej pre štúdium kvasinkových MDR púmp na Oddelení biofyziky FÚ UK, pre štúdium činnosti P-glykoproteínu v ľudských nádorových bunkách. Fluorescenčná metóda je založená na použití redistribučnej potenciometrickej sondy diS-C3(3), o ktorej sme zistili, že je substrátom P-glykoproteínu. Optimalizácia metódy (experimentálne okno) umožnila citlivé monitorovanie zmien aktivity P-glykoproteínu účinkom niekoľkých jeho známych inhibítorov/substrátov: oligomycínu, amiodaronu, verapamilu, vinblastínu, ketokonazolu, itrakonazolu a FK506. V rámci práce boli získané nové, dôležité výsledky týkajúce sa účinku týchto medicínsky významných látok na ľudské bunky. Vyvinutá metóda bude nepochybne veľkým prínosom v budúcnosti pri hľadaní nových účinných inhibítorov a skúmaní mechanizmov ich účinku.
|
|
|
Vývoj scaffoldů pro regeneraci kostních defektů
Prosecká, Eva ; Amler, Evžen (vedoucí práce) ; Rosina, Jozef (oponent) ; Gášková, Dana (oponent)
Výsledkem in vitro a in vivo studií je nový, biokompatibilní, biodegradabilní, osteokonduktivní a osteoinduktivní 3D scaffold s vysokým potenciálem pro klinické použití. Scaffold složený z 0.5% kolagenu typu I s 50 % hydroxyapatitu s velikostí pórů v průměru 400 μm, je vhodný pro buněčnou migraci, proliferaci, diferenciaci a vaskularizaci. Následně přidaná poly-ɛ-kaprolaktonová nanovlákna zlepšila mechanické vlastnosti scaffoldu. Scaffold byl dále obohacen mesenchymálními kmenovými buňkami a trombocytárním koncentrátem jako přírodním zdrojem růstových faktorů. Tento funkcionalizovaný scaffold byl postupně nahrazen novou kostní tkání po implantaci in vivo, a to v celém objemu defektu, v kondylu femuru králíka za jeho postupné biodegradace. Pro výrobu tohoto scaffoldu byly navíc použity materiály a výrobní postupy splňující podmínky Evropské lékové agentury pro humánní použití. V průběhu experimentů byl též vyvinut slibný systém pro dodávání bioaktivních látek pro regeneraci kostní tkáně založený na koaxiálních nanovláknech z poly-ɛ-kaprolaktonu a polyvinylalkoholu.
|
|
|
Plazmatická úprava funkcionalizovaných PVA nanovláken za účelem zvýšení adheze, viability a proliferace mezenchymálních kmenových buněk.
Bezděková, Dagmar ; Amler, Evžen (vedoucí práce) ; Gášková, Dana (oponent)
Elektrostatické zvlákňování je široce používaná technika přípravy konstruktů pro účely tkáňového inženýrství. Pomocí této techniky se dá zvláknit široké množství polymerů. Jedním z nich je i polyvinylalkohol (PVA), který má velmi dobré vlastnosti k uplatnění v tomto oboru. Je netoxický, mechanicky odolný a degradabilní a biokompatibilní. Vytvořená vlákna mají limitované použití kvůli přítomnosti postranních -OH skupin, které jsou příčinou rozpustnosti PVA ve vodě. Rozpustnost se dá upravit síťovacími technikami, avšak i přesto kvůli vysoké hydrofilitě na PVA adherují buňky jen velmi omezeně. V současné práci jsme se hydrofilitu rozhodli upravit použitím plazmatické modifikace. Úprava studeným plazmatem je ekonomický a poměrně jednoduchý způsob, jak upravit povrchové složení polymeru bez vedlejších účinků, které s sebou přináší konvenční chemické úpravy. Pomocí výboje a tvorby radikálů se nám podařilo deponovat uhlovodíky na PVA vrstvu a rapidním způsobem zvýšit hydrofobnost povrchu. Změna povrchové chemie měla poměrně malý vliv na vlákennou strukturu vzorku a morfologii jednotlivých vláken. Zvýšení hydrofobnosti zapříčinilo lepší adhezi mezenchymálních kmenových buněk na plazmaticky upravené PVA v porovnání s neupraveným PVA a velkou změnu v morfologii buněk. Tato změna naznačuje, že jsme PVA...
|
host ::
RSS.