|
|
Studium esenciality genu glmM kodujiciho fosfoglukosaminmutasu Streptococcus pneumoniae.
Krupička, Jiří ; Branny, Pavel (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
Fosfoglukozaminmutáza (GlmM) představuje enzym hrající roli v biosyntéze buněčné stěny bakterií. Hlavním záměrem této diplomové práce bylo zjistit, zda je gen glmM esenciální pro životaschopnost Streptococcus pneumoniae. Za tímto účelem jsme vytvořili merodiploidní kmen obsahující dvě kopie glmM - nativní gen a jeho ektopickou kopii pod kontrolou inducibilního zinkového promotoru. Delecí nativního genu glmM jsme vytvořili mutantní kmen, u něhož jsme analyzovali životaschopnost a fenotyp v médiu s různými koncentracemi zinečnatých iontů, induktoru exprese ektopické kopie glmM. Zjistili jsme, že životaschopnost mutantního kmene je striktně závislá na koncentraci induktoru v médiu a úbytek GlmM se u buněk projevuje výraznými morfologickými defekty a sklonem k lyzi. Prokázali jsme, že následné vyrovnání koncentrace induktoru v médiu na koncentraci odpovídající kontrolnímu vzorku komplementuje projevy úbytku GlmM. Tyto výsledky dokazují esencialitu glmM pro životaschopnost S. pneumoniae. Dále jsme analyzovali, zda je pro funkčnost GlmM esenciální fosforylace na klíčových aminokyselinových zbytcích S99 a S101. Cílenou mutagenezí jsme připravili čtyři varianty plazmidů nesoucích glmM kódující záměny serinových zbytků za alanin nebo kyselinu glutamovou a transformovali je za vzniku čtyř merodiploidních kmenů, v...
|
|
|
Studium funkce proteinu Spr1057 Streptococcus pneumoniae
Stehlíková, Zuzana ; Branny, Pavel (vedoucí práce) ; Fišer, Radovan (oponent)
Studium funkce proteinu Spr1057 Streptococcus pneumoniae V genomu významného lidského patogena Streptococcus pneumoniae je kódován pouze jediný gen pro serin/threoninovou proteinkinázu eukaryotního typu, označovanou StkP. Analýzou globálního transkriptomu mutantního kmene s delecí genu pro StkP byl identifikován gen spr1057, jehož exprese byla v kmeni ∆stkP významně reprimována. Produktem tohoto genu je protein Spr1057, člen enzymatické skupiny haloacid dehalogenáz. Z výsledků biochemické charakterizace a testování substrátové specifity proteinu Spr1057 byla potvrzena jeho nukleotidázová aktivita v podmínkách in vitro. Za účelem studia funkce tohoto proteinu in vivo byly připraveny mutantní kmeny S. pneumoniae. Růstové vlastnosti vytvořených kmenů byly sledovány v přítomnosti modifikovaných nukleotidů 5-fluoro-2'-deoxyuridinu (5-FdU) a 5-bromo-2'-deoxyuridinu (5-BrdU) a byla porovnávána míra inkorporace 5-BrdU do chromozomální DNA mutantních kmenů oproti divokému kmeni S. pneumoniae. Růst kmene Δspr1057 byl v přítomnosti modifikovaných nukleotidů výrazně inhibován a zaznamenána byla rovněž okamžitá inkorporace 5-BrdU do DNA, zatímco u divokého kmene k inhibici růstu ani inkorporaci 5-BrdU do DNA nedošlo. Exprese ektopické kopie genu spr1057 z inducibilního promotoru vedla ke komplementaci deficience...
|
|
|
Pleiotropní efekt proteinů s WD-40 doménami na buněčnou diferenciaci a produkci sekundárních metabolitů u Streptomyces coelicolor
Ulrych, Aleš ; Branny, Pavel (vedoucí práce) ; Pátek, Miroslav (oponent) ; Španová, Alena (oponent)
Pleiotropní efekt proteinů s WD-40 doménami na buněčnou diferenciaci a produkci sekundárních metabolitů u Streptomyces coelicolor WD-40 domény, také známé jako beta-transducinové repetice, jsou vysoce konzervované aminokyselinové repetice, které se nacházejí v mnoha odlišných eukaryotních proteinech, kde plní širokou škálu funkcí. Koncem 90. let minulého století byly identifikovány první proteiny s WD-40 doménami u prokaryot, ale o jejich funkci není známo téměř nic. Streptomyces coelicolor je grampozitivní bakterie s komplikovanou buněčnou morfologií a fyziologickou diferenciací během životního cyklu. Genom Streptomyces coelicolor kóduje 6 pravděpodobných genů kódujících proteiny s WD-repetitivními motivy. Pro bližší porozumění funkce dvou z těchto WD-40 genů (wdpB a wdpC) byly připraveny jejich disrupční mutanty, u kterých byl stanoven fenotypový projev a provedena transkripční analýza. Oba mutantní kmeny vykazovaly aberantní fenotyp závislý na použitém kultivačním médiu s nejvýraznějším fenotypovým projevem mutantů na modifikovaném R3 agaru. Fenotypové studie odhalily, že delece genu wdpB způsobuje značnou redukci tvorby vzdušného mycélia a sníženou produkci undecylprodigiosinu. Kromě toho dochází u mutantaΔ wdpB k neobvyklému větvení vzdušného mycélia a k defektní sporulaci projevující se...
|
|
|
Studium funkce Ser/Thr proteinkináz a fosfatáz Pseudomonas aeruginosa
Goldová, Jana ; Branny, Pavel (vedoucí práce) ; Nešvera, Jan (oponent) ; Španová, Alena (oponent)
Reverzibilní fosforylace proteinů je považována za univerzální mechanizmus v intracelulární komunikaci všech živých organizmů. Tento proces, katalyzovaný proteinkinázami a fosfatázami, umožňuje přeložit extracelulární signály do odpovídající buněčné odpovědi a umožňuje tak adaptaci na změny podmínek v prostředí. V posledních letech byla objevena celá řada Ser/Thr proteinkináz a fosfatáz eukaryotního typu u bakterií, jejich přesná funkce a substráty však nejsou zatím příliš prostudovány. Podmíněný lidský patogen Pseudomonas aeruginosa obsahuje ve svém chromozomu minimálně 5 genů kódujících předpokládané Ser/Thr proteinkinázy a fosfatázy eukaryotního typu. V první části této práce jsme se pokusili stanovit fyziologickou roli Ser/Thr proteinkinázy PpkA a fosfatázy PppA, které jsou součástí sekrečního systému typu VI H1-T6SS. V kmeni P. aeruginosa PAO1 jsme připravili dvojitého delečního mutanta ∆pppA- ppkA. Fenotypová analýza prokázala, že v porovnání s divokým kmenem vykazuje mutantní kmen pomalejší růst v minimálním médiu a sníženou produkci pigmentu pyocyaninu. Mutant dále prokazoval významně sníženou odolnost k oxidativnímu stresu a naopak zvýšenou odolnost k hyperosmotickému stresu. V souladu s pozorovanou sníženou odolností k oxidativnímu stresu mutantní kmen hůře přežíval v baktericidním...
|
|
|
Nekonveční bakteriální signální dráhy
Krupička, Jiří ; Branny, Pavel (vedoucí práce) ; Beranová, Jana (oponent)
Dvoukomponentové systémy byly tradičně považovány za hlavní fosforylační systémy bakterií zapojené v buněčné signalizaci. V poslední době se však pozornost stále více soustředí na bakteriální Ser/Thr proteinkinázy eukaryotického typu (eSTKs). Tyto proteinkinázy jsou strukturně podobné svým eukaryotickým protějškům. Některé eSTKs obsahují přídavné domény jako jsou extracelulární PASTA domény, které byly objeveny u různých grampozitivních bakterií. Bylo prokázáno, že tyto domény mohou sloužit jako senzory pro volné peptidoglykanové fragmenty. Naprostá většina vnějších signálních molekul však stále zůstává neznámá. eSTKs fosforylují široké spektrum substrátů, mezi které patří proteiny účastnící se různých buněčných procesů jako je virulence, biosyntéza buněčné stěny, buněčné dělení nebo centrální a sekundární metabolismus. Bylo také popsáno propojení mezi eSTKs a dvoukomponentovými systémy. Tato práce pojednává o současných poznatcích, které se týkají zejména eSTKs a jejich důležitých substrátů, jež byly identifikovány a charakterizovány u různých druhů bakterií.
|
|
|
Cytoplasmic membrane of Bacillus subtilis Regulation of the physical parameters
Beranová, Jana ; Konopásek, Ivo (vedoucí práce) ; Branny, Pavel (oponent) ; Holoubek, Aleš (oponent)
Bacillus subtilis, modelová Gram-pozitivní bakterie, uplatňuje při adaptaci své membrány k nízkým teplotám dva odlišné mechanismy: 1) Při dlouhodobé adaptaci k nižším teplotám dochází ke zvýšení poměru anteiso/iso-větvených mastných kyselin v membránových lipidech. 2) Po náhlém poklesu teploty je indukována syntéza desaturázy (Des), proteinu, který v aerobních podmínkách desaturuje řetězce mastných kyselin v lipidech cytoplazmatické membrány. Transkripce genu des, kódujícího desaturázu mastných kyselin, je indukována zvýšením uspořádanosti membrány. Pro indukci transkripce genu des je nezbytná účast dvoukomponentového systému DesK-DesR. V této práci jsem sledovala, jak kultivační podmínky ovlivňují mechanismus adaptace membrány B. subtilis k nízkým teplotám. Použity byly metody fluorescenční spektroskopie, analýza mastných kyselin, diferenciální skenovací kalorimetrie a metody molekulární biologie. V první části práce jsem se zabývala vlivem složení kultivačního media na chemické složení a biofyzikální parametry cytoplazmatické membrány B. subtilis během růstu v optimální (40 řC) a suboptimální (20 řC) teplotě. Srovnávala jsem komplexní medium s glukózou bohaté na živiny a dvě média minerální obsahující buď glukózu nebo glycerol jako zdroj uhlíku. Získaná data jasně ukazují zásadní vliv složení...
|
|
|
Funkční studie potenciální nukleotidázy kódované genem spr1057 Streptococcus pneumoniae, homologa proteinu YjjG E. coli
Vacková, Zuzana ; Lichá, Irena (oponent) ; Branny, Pavel (vedoucí práce)
ČESKÝ ABSTRAKT Funkční studie potenciální nukleotidasy kódované genem spr1057 v Streptococcus pneumoniae, homologa proteinu YjjG Escherichia coli. Bakteriální buňky jsou neustále vystavovány nespočetným toxickým látkám, ať už z vnějšího prostředí či vedlejším produktům jejich vlastního metabolismu. Z těchto důvodů jsou bakteriální buňky vybaveny několika mechanismy, které tyto toxické látky eliminují. Jedná se hlavně o: blokaci adsorbce, transport specifickými transportéry a specifickou inaktivaci těchto látek enzymy. Zvláštní skupinu těchto toxických látek jsou modifikované nukleotidy, které mohou v bakteriální buňce přímo zabránit replikaci DNA, nebo způsobit mutace. Enzymy rozpoznávající tyto modifikované deriváty se označují jako "house-cleaning" "úklidové" nukleotidfosfatasy, působí na modifikované potenciálně mutagenní nukleotidy a zabraňují tak jejich včlenění do DNA či RNA. Část z těchto "úklidových" enzymů se řadí do skupiny haloacid dehalogenas (haloacid dehalogenase-like hydrolase superfamily), nalezených u mnoha bakteriálních druhů. Tato diplomová práce je zaměřena na funkční studii hypotetického proteinu Spr1057 Streptococcus pneumoniae o doposud neznámé funkci. Na základě sekvenčního srovnání vyplynulo, že Spr1057 má významnou podobnost s proteinem YjjG Escherichia coli. Analýza transkriptomu...
|
|
| |
|
| |
|
| |
host ::
RSS.