|
|
Structure-assisted development of a continuous carboxypeptidase assay
Rakhimbekova, Anastasia ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Bouřa, Evžen (oponent)
Glutamát karboxypeptidasa II (GCPII) je zinek-dependentní karboxypeptidasa s vysokou hladinou exprese u karcinomu prostaty. Vzhledem k tomu, že daný enzym představuje ověřený cíl pro terapii a zobrazování rakoviny, je vývoj nových ligandů specifických pro GCPII stále předmětem aktivního akademického a průmyslového výzkumu. Stávající analýzy pro screening knihoven inhibitorů a stanovení účinnosti inhibitorů nejsou však optimální. Tato diplomová práce je zaměřena na vývoj malých interně zhášených sond, které by mohly být použity pro kontinuální měření enzymatické aktivity GCPII. Tyto sondy jsou odvozeny z přirozených substrátů GCPII a sestávají z páru fluorofor/zhášeč spojeného GCPII- hydrolyzovatelným linkerem. Nejprve jsem charakterizovala biofyzikální vlastnosti sond a poté stanovila kinetické parametry jejich hydrolýzy GCPII. Optimalizovaná metoda pro stanovení karboxypeptidasové aktivity byla použita pro určení IC50 u několika GCPII-specifických inhibitorů. Nakonec komplexy mezi neaktivním enzymem a uvedenými sondami byly kokrystalizovány, a pro jeden z komplexů byly provedeny upřesnění a analýza struktury. Naše data naznačují, že sondy jsou zapojeny do nekovalentních interakcí se stejnými aminokyselinovými zbytky aktivního místa enzymu jako přirozené substráty. Vyvinutá analýza může být...
|
|
|
SARS-CoV-2 methyltransferázy jako cíl terapeutického zásahu
Kocek, Hugo ; Nencka, Radim (vedoucí práce) ; Bouřa, Evžen (oponent)
Nový koronavirus SARS-CoV-2 (z počátku též označovaný "nCoV2019") se stal od března roku 2020 součástí našich životů a téměř přes noc obrátil naše životy "vzhůru nohama". Tento vir se přenáší kapénkami a způsobuje respirační onemocnění COVID-19, které může mít v komplikovaných případech velmi závažný až fatální průběh. Doposud nebyla vynalezena žádná efektivní léčebná metoda a vakcíny jsou momentálně velkou nadějí. Ačkoli poskytují vysokou míru ochrany vůči SARS-CoV-2, je důležité podotknout, že nemusí být plně efektivní vůči stále se objevujícím novým mutacím SARS-CoV-2. V průběhu pandemie byla vyzkoušena řada již schválených léků (např. favipiravir, toremifen či hydroxychlorochin), ale žádný z těchto léků v klinických studiích neprokázal signifikantní účinnost proti SARS-CoV-2. Jediným schváleným antivirotikem pro použití u hospitalizovaných pacientů je v současné době nukleotidový analog remdesivir, jehož účinnost byla prokázána v klinických testech, ale je patrně značně závislá na době podání a celkovém stavu pacienta. Vývoj nových antivirotik je proto nezbytný, neboť se jedná již o třetí korovirus od počátku 21. století s pandemickým potenciálem, a proto můžeme očekávat příchod dalších variant v budoucnosti. Tato práce se zaměřuje na S-adenosylmethionin-dependentní methyltransferázy nsp14 a...
|
|
|
Příprava vybraných rekombinantních proteinů viru Aichi a dalších kobuvirů
Ludvík, Tomáš ; Bouřa, Evžen (vedoucí práce) ; Petrvalská, Olívia (oponent)
Virová 2Apro zastává mnoho důležitých funkcí v životním cyklu viru. Jedná se o proteasu, jež se podílí na štěpení virového polyproteinu v úseku VP1/2A. Struktura proteinu obsahuje tzv. aktivní místo, díky kterému dokáže protein vázat různé substráty v hostitelské buňce, což je esenciální pro virovou infekci. Pomocí 2Apro dokáže virus obejít imunitní odpověď hostitele a zastavit produkci klíčových hostitelských proteinů. Proto je proteasa 2Apro vhodný cíl pro zásah antivirotiky. V rámci této práce byly připraveny dva rekombinantní proteiny 2Apro z Aichi viru a Coxsackie viru B3. Jedná se o viry z rodiny Picornaviridae, které patří mezi lidské patogeny, jež v některých případech způsobují závažná onemocnění. Aichi virus je původcem gastroenteritidy a Coxsackie virus B3 v nejhorších případech způsobuje dilatační kardiomyopatii. Kardiomyopatie vede ke špatné funkci srdce důsledkem jeho rozšíření, čímž může dojít až k srdečnímu selhání. Klíčová slova: rekombinantní proteiny, 2Apro , Aichi virus, Coxsackie B3 virus
|
|
|
Structural and functional study of viral RNA polymerases
Dubánková, Anna ; Bouřa, Evžen (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent) ; Plevka, Pavel (oponent)
Virové RNA dependentní RNA polymerázy (RdRp) jsou enzymy nezbytné pro množení RNA virů. Obecná funkce RdRp je pro všechny RNA viry stejná: RdRp rozpozná virovou RNA, nasedne na ni a syntetizuje komplementární řetězec RNA. Série těchto kroků je pro virovou infekci naprosto nepostradatelná. Je důležité si uvědomit, že neinfikovaná buňka RNA nereplikuje. Hostitelská buňka přirozeně neexprimuje žádné RdRp. Pro můj výzkum jsem si vybrala RdRp, protože jsou nezbytné pro virovou replicakci a tudíž excelentní cíl pro virovou terapii. V této studii jsou do hloubky charakterizovány polymerázy z rodiny picornavirů a flavivirů. Picornavirová replikace je lokalizovaná ve viry indukovaných, membránových strukturách, které nazýváme replikační organely (RO). V těchto RO je virová polymeráza lokalizovaná na membráně. Nalezli jsme podmínky, ve kterých se polymeráza váže na membránu. Následně byla studována aktivace picornavirových polymeráz, která je indukována inzercí první aminokyseliny do středu proteinu. V této studii jsou rovněž diskutovány RdRp z rodiny flavivirů, konkrétně z viru žluté zimnice (YFV) a Zika viru (ZIKV). Studie prezentuje první strukturu polymerázy z YFV (v plné délce) a model ZIKV polymerázy v komplexu s RNA. Model ZIKV poskytuje strukturní informaci o aktivním místě potřebnou k "dockingu" ligandů.
|
|
|
Strukturní studie inhibičních mechanismů kinas fosfatidylinositolu.
Gregor, Jiří ; Bouřa, Evžen (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent)
+ssRNA viry po vstupu do buňky tvoří platformy pro svoji replikaci - replikační organely. V těchto oblastech je díky činnosti fosfatidylinositol 4-kinasy zvýšená koncentrace PI4P, který vytváří vhodné prostředí pro vazbu virové polymerasy 3DPOL . Jednou z těchto kinas je PI4KB, která je vázána na membránu prostřednictvím ACBD3 proteinu, který je sám k membráně vázán interakcí s giantinem. Některé kobuviry a enteroviry z čeledi Picornaviridae pomocí nestrukturního proteinu 3A vytěsní ACBD3 protein z vazby s gigantinem a přemístí ho z Golgiho aparátu do replikační organely. Na ACBD3 se zde váže PI4KB a následně katalyzuje vznik PI4P. V Golgiho aparátu byly objeveny pouze dva proteiny - TBC1D22A a TBC1D22B - které se váží do stejného místa ACBD3 proteinu jako PI4KB. Cílem této práce bylo ověřit interakci peptidů z proteinů TBC1D22A a TBC1D22B s ACBD3 proteinem a zjistit sílu této interakce. Dalším cílem bylo vykrystalizovat komplexy těchto interakčních partnerů a následně vyřešit jejich trojrozměrné struktury. Bylo zjištěno, že interakce ACBD3 proteinu s peptidy TBC1D22A a TBC1D22B je mnohem slabší než interakce ACBD3 s PI4KB. Podařilo se připravit krystaly komplexu ACBD3 s TBC1D22A, ale bohužel difraktovaly jen k velmi nízkému rozlišení, a tudíž struktura nemohla být vyřešena.
|
|
|
Molekulární mechanismy regulace forkhead transkripčního faktoru FOXO4
Bouřa, Evžen ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Konvalinka, Jan (oponent) ; Schneider, Bohdan (oponent)
8. Závěr H|avním cílem předkládané práce by|o studium molekulárních mechanismů interakce forkhead transkripčního faktoru FOXO4 s DNA a mechanismus regulace jeho vazby na DNA, zejména úloha fosforylace proteinkinasou B a regulačnífunkce l4-3- 3 proteinu. Naše qýsledky ukazují, žepro vazbu na DNA jsou u forkhead transkripčníhofaktoru FoXo4 dů|ežitéobě hraničníoblasti forkhead doméIry * jak N-koncová smyčka,která se nachází před helixem Hl, tak C-koncová část známá jako křídlo W2. Bylo zjištěno, žeodstranění jedné z těchto částís|abě snižuje DNA vazebný potenciál FOXO4-DBD, zatímco současnéodstranění obou těchto ob|astí výrazně inhibuje vazbu na DNA. Dále jsme se zaměřili na úlohu fosforylace C-koncové části forkhead domény. FoXo4 má tři fosforylačnímísta pro proteinkinasu B, z nichž jedno se nacházi přímo ve forkhead DNA vazebné doméně a to na jejím C-konci v oblasti Kíd|a W2. Zjistili jsme, že v přítomnosti N-koncové smyčky má fosfory|ace kříd|a W2 proteinkinasou B pouze ma|ý v|iv navazbu DNA. Na druhé straně v nepřítomnostitéto smyčky fosforylace křídla W2 silně inhibuje DNA vazebný potenciál FOXO4-DBD. Yazba 14-3-3 proteinu efektivně snižuje DNA vazebný potenciál FOXO4-DBD, ať užje N-koncová smyčka přítomna nebo ne. Naše ýs|edky ukazují, Že jak N-koncová, tak C-koncová část FoXo4-DBD jsou dů|eŽitépro...
|
|
|
Vývoj biosenzoru pro fosfatidylinositol
Eisenreichová, Andrea ; Bouřa, Evžen (vedoucí práce) ; Petráčková, Denisa (oponent)
Fosfatidylinositol je minoritním komponentem membrán eukaryotických buněk. Vedle strukturní funkce má i zásadní roli v buněčné signalizaci jako prekursor několika signalizačních molekul a sekundárních poslů. Jedná se o fosfoinositidy, které vznikají fosforylací hydroxylových skupin fosfatidylinositolu v pozicích 3,4 a 5 inositolového kruhu. I přes důležitou roli fosfatidylinositolu však zůstává jeho prostorová a časová a dynamika v buňce nevyjasněná, především z důvodu neexistence odpovídající specifické optické próby (biosenzoru) pro jeho vizualizaci. Pro konstrukci biosenzorů pro inositolové fosfolipidy se využívají lipid-vazebné domény jejich efektorových proteinů s dostatečnou afinitou a specifitou pro daný fosfoinositid. Pro fosfatidylinositol takováto doména není známa, ale je znám enzym, bakteriální fosfatidyl-inositol specifická fosfolipasa C, který se na PI specificky váže. Tento enzym následně katalyzuje hydrolýzu fosfatidylinositolu za vzniku diacylglycerolu a inositol 1-fosfátu a na rozdíl od eukaryotických homologů neštěpí fosforylované formy fosfatidylinositolu. Cílem této diplomové práce bylo vyřešit modely struktur komplexů několika neaktivních mutantních forem fosfolipasy C z Bacillus cereus s myo-inositolem, které by dále sloužily jako podklad pro konstrukci geneticky...
|
|
|
The crystal structure of PI4 kinase
Bäumlová, Adriana ; Bouřa, Evžen (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Bařinka, Cyril (oponent)
Fosfatidylinositol 4-kinázy (PI4K/PI4-kinázy) katalyzují produkci fosfatidylinositol 4- fosfátu (PtdIns4P), první krok v tvorbě vyšších fosfoinositidů. Fosfatidylinositol 4-fosfát je esenciálním prekurzorem pro tvorbu druhých poslů, fosfatidylinositol(1,4,5)trifosfátu a diacylglycerolu, které vznikají v signalizační dráze zahájené receptorem aktivovanou fosfolipázou C. Kromě toho fosfatidylinositol 4-fosfát reguluje procesy specificky se odehrávající v buněčných kompartmentech a to prostřednictvím vazby širokého spektra efektorových molekul na membránu. Jelikož PI4-kinázy mají ústřední pozici v tvorbě fosfatidylinositol 4-fosfátu probíhající na povrchu intracelulárních membrán, jsou tímto způsobem zodpovědné za procesy zprostředkované fosfatidylinositol 4-fosfátem jako například transport lipidů a jejich metabolizmus, transportní procesy v buňce a řízení transportovaného nákladu, remodelace membrán a cytoskeletu, přenos signálu do buňky a mnoho jiných. U savců byly identifikovány dva druhy PI4-kináz: typu II a typu III. Tyto typy kináz si nejsou sekvenčně podobné, a proto mají odlišné biochemické vlastnosti. Abychom objasnili strukturní příbuznost PI4-kináz, je zapotřebí strukturní analýzy. Strukturní charakterizace jednotlivých PI4-kináz by taktéž umožnila objasnit mechanizmus katalýzy vzniku...
|
|
|
Strukturní charakterizace replikace RNA lidského Aichi viru
Dubánková, Anna ; Bouřa, Evžen (vedoucí práce) ; Teisinger, Jan (oponent)
Virové RNA dependentní RNA polymerasy (RdRp) jsou enzymy, které umožňují RNA virům replikovat svůj genom a také připravit mediátorovou RNA pro translaci virových proteinů. Díky své relativní evoluční konzervovanosti jsou RdRp dobrým cílem pro design léčiv. V této práci ukazujeme strukturu RdRp, 3Dpol z Aichi viru, která doposud nebyla vyřešena. Aichi virus je lidský patogen, který způsobuje gastroenteritidu. Aichi virus se také používá jako modelový organismus pro studium příbuzných virů, které jsou svou virulencí mnohem nebezpečnější, jako je Rhinovirus, virus hepatitidy A, SARS, virus hepatitidy C, virus žluté horečky nebo západo-Nilský virus. Kromě strukturní studie 3Dpol z Aichi viru se v této práci zabýváme ověřením hypothesy, podle které se protein 3Dpol váže na membránu skrze fosfatidylinositol 4 fosfát (PI4P z angl. "phosphatidylinositol 4 phosphate") - významný regulační lipid. Membrány bohaté na PI4P vznikají v buňkách po infekci jednovláknovými plus RNA (ssRNA z angl. "single - stranded") viry. V neposlední řadě jsme zkoumali vliv ribonukleotidů na stabilitu proteinu 3Dpol.
|
|
|
Studium mechanismu rozpoznávání DNA transkripčním faktorem FOXO4
Zusková, Iva ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Bouřa, Evžen (oponent)
Forkhead transkripční faktor FOXO4 se podílí na kontrole řady buněčných dějů, jako jsou např. metabolismus, buněčný cyklus, apoptóza, oprava poškozené DNA či ochrana vůči oxidativnímu stresu. Krystalová struktura DNA-vazebné domény tohoto proteinu s navázanou DNA ukázala, že FOXO4 interaguje s DNA podobně jako jiné forkhead proteiny. DNA- vazebný povrch je tvořen zejména helixem H3, který se váže do velkého žlábku molekuly DNA, a dále N-koncovým segmentem a flexibilními ohyby na C-konci domény. Nicméně řada otázek, zejména ohledně mechanismu regulace specifičnosti při rozpoznávání DNA a úlohy jednotlivých částí domény v tomto procesu, zůstává stále nejasná. V rámci této diplomové práce byla studována interakce DNA-vazebné domény FOXO4 s DNA o různých sekvencích. Tento protein a řada jeho mutantů byla exprimována a purifikována a interakce s DNA byly studovány pomocí metod fluorescenční spektroskopie a resonance povrchového plasmonu. Výsledky těchto experimentů ukázaly, že nukleotidová sekvence na 5′ konci od hlavního vazebného motivu ovlivňuje stabilitu komplexu DNA-vazebné domény FOXO4:DNA. Dále se podařilo objasnit význam jednotlivých aminokyselin FOXO4, které se podílejí na vazbě na DNA, na stabilitě výsledného komplexu.
|
host ::
RSS.