|
|
Konformace adenylátcyklázového toxinu Bordetella pertussis.
Motlová, Lucia ; Fišer, Radovan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Holoubek, Aleš (oponent)
Tato práce se zabývá uspořádáním RTX ("Repeats in ToXin") domén vybraných RTX toxinů a vlivem těchto struktur především na balení toxinů do nativní struktury jejich sekreci a. Pro strukturní analýzu byly vybrány RTX domény ApxI (Actinobacillus pleuropneumoniae-RTX- toxin I) z bakterie Actinobacillus pleuropneumoniae, HlyA (Alfa-hemolysin) z bakterie Escherichia coli a LtxA (Leukotoxin A) z bakterie Aggregatibacter actinomycetemcomitans a bloky 4 a 5 RTX domény CyaA (adenylátcyklázový toxin) z bakterie Bordetella pertussis. Podařilo se získat a charakterizovat struktury RTX domény Ltxa A a RTX bloky 5 a 4-5 CyaA. Na základě SAXS (maloúhlový RTG rozptyl) modelu, dříve vyřešených struktur RTX proteinů a zde prezentovaných struktur byly vytvořeny dva modely celé rozsáhlé RTX domény CyaA.
|
|
|
Drop coating deposition Raman spectroscopy of biologically important molecules
Kuižová, Alžbeta ; Kočišová, Eva (vedoucí práce) ; Holoubek, Aleš (oponent)
Ramanova spektroskopie kapkově nanášených povlaků (DCDR) je speciální metodou Ramanovy spektroskopie, která je založená na zasychání kapek roztoku nebo suspenze na hydrofóbním substrátu, co ve většině případů vede k tvorbě prstence známého jako "kávový kroužek". Výsledkem je zakoncentrování materiálu a vyšší intenzita Ramanova signálu ve srovnání s Ramanovym rozptylem z roztoku. V práci byly porovnány substráty s různou drsností a hydrofobicitou: hladký substrát s vrstvou polytetrafluoretylenu (pPTFE) a nanodrsné substráty, kde byla hydrofobicita povrchu zvýšená nadeponovanými měděnými nebo stříbrnými nanočásticemi s různou koncentrací. Pro suspenzi liposomů z lipidu DPPC docházelo k lepšímu zakoncentrování v případe substrátů s vyšším kontaktním uhlem, kde je vyšší hydrofobicita dosáhnuta nanodrsným povrchem. Mezi jednotlivými zdrsněnými substráty k výraznému zlepšení nedocházelo. V případě schnutí kapek při různých teplotách (v rozsahu od 15 do 60řC) nanesených na hladký pPTFE substrát a povrch s nadeponovanými stříbrnými nanočásticemi, Ramanova spektra neukázala spektrální změny souvisící s fázovým přechodem lipidů. Pro teploty zasychání vyšší než teplota fázového přechodu byly na vzniklých prstencích pozorovány nehomogenity, které při teplotě 45řC vedly k vyššímu Ramanovu signálu. Závěrem, k lepšímu...
|
|
|
Bakteriální RTX proteiny a jejich vazebná místa pro vápník.
Lišková, Petra ; Konopásek, Ivo (vedoucí práce) ; Holoubek, Aleš (oponent) ; Hof, Martin (oponent)
Protein FrpC je produkovaný bakterií Neisseria meningitidis v lidském hostiteli. Tento protein je charakteristický přítomností RTX domény, která jej řadí do stejnojmenné rodiny bakteriálních toxinů. Protein FrpC vykazuje unikátní autokatalytickou štěpící aktivitu, kterou zajišťuje 177 aminokyselin dlouhá část (SPM, Self-Processing Module). Bez navázaného Ca2+ zaujímá SPM neuspořádanou strukturu. Po vazbě iontu se protein sbalí a je schopen vykonat enzymatickou aktivitu. Analýza struktury sbaleného SPM by mohla odhalit funkční souvislosti vazby iontu a autokatalytického sestřihu. Bohužel řešení struktury SPM pomocí NMR se ukázalo být velmi obtížné kvůli dlouhé nestrukturované části sekvence uvnitř SPM. Předmětem této práce se tedy stal popis SPM pomocí fluorescenčních metod, charakterizace vazby iontu do SPM, tak i strukturních změn, které se v průběhu vazby Ca2+ odehrávají. Byla stanovena disociační konstanta vazby kovového iontu do SPM, kD~17 µM, která se nachází v koncentračním rozmezí Ca2+, kdy dochází ke sbalování SPM proteinu (1-20 µM). Součástí pochopení struktury SPM bylo zjištění, že obě tryptofanová rezidua Trp451 a Trp519 v SPM interagují jak s navázanými ionty, tak spolu navzájem. Pro tento účel byly použity plně funkční varianty SPM s jedním tryptofanem, W451F a W519F, a luminiscenční...
|
|
|
Interakce liposomů s porfyriny studována pomocí Ramanovy spektroskopie kapkově nanášených povlaků
Vaculčiaková, Lenka ; Kočišová, Eva (vedoucí práce) ; Holoubek, Aleš (oponent)
Kationické porfyriny rozpustné ve vodě byly studovány v souvislosti s an- tisenzní terapií, kde byly úspěšně použity jako podpůrný prostředek k průniku oligonukleotidů do buněk. Hlavním cílem práce bylo charakterizovat mechanis- mus interakce liposomů, jako membránového modelu, s porfyriny. Ke zkoumání jejich komplexů jsme využili Ramanovou spektroskopii kapkově nanášených povlaků (DCDR), která využívá efektu tvorby "kávového kroužku" k zakoncentrování vzorku na okraji kapky a umožňuje tak studium komplexů s nízkou výchozí kon- centrací. Zkoumali jsme čtyři komplexy, kombinace dvou lipidů: 1, 2−dipalmitoyl− sn−glycero−3−phosphocholine, 1, 2−dioleoyl−sn−glycero−3−phospho−(1 − rac − glycerol) a dvou porfyrinů: copper 5, 10, 15, 20 − tetrakis(1 − methyl − 4 − pyridyl)porphyrin, copper 5, 10, 15, 20−tetrakis(4−sulfonatophenyl)porphyrin. Zjistili jsme, že způsob jejich interakce v komplexu silně závisí na konkrétním lipidu a porfyrinu. Pozorovali jsme částečnou inkorporaci porfyrinů do lipo- somální dvojvrstvy, lokalizaci na povrchu liposomů a také změnu v konformaci a uspořádání lipidových molekul. Také jsme zjistili, že rozložení porfyrinů v zaschlé kapce vykazuje náhodnou nehomogenní distribuci. 60
|
|
|
Drop coating deposition Raman spectroscopy of liposomes with different compositions
Antalík, Andrej ; Kočišová, Eva (vedoucí práce) ; Holoubek, Aleš (oponent)
Metóda kvapkovo nanášaných povlakov je špeciálna technika Ramano- vej spektroskopie spočívajúca v nanesení malého množstva vzorky na hy- drofóbny povrch s následným odparením rozpúšt'adla. Po vyschnutí dochádza k sústredeniu materiálu v homogénnom krúžku na okraji kvapky. Použitie tejto techniky sa ukázalo ako vhodné na štúdium lipozómov pri nízkych koncentráciách. Jej využitím sme skúmali prejavy cholesterolu v spektrách prevažne fosfatidylcholínových lipozómov, a tiež jeho vplyv na tvorbu krúžkov. Vyššia koncentrácia cholesterolu nespôsobila výraznejšie zmeny štruktúry membrány, ako napríklad zmenu fázy, avšak nedochádzalo k vytvoreniu krúž- kov. V druhej časti bakalárskej práce sme sa zaoberali hl'adaním vhodnej alternatívy k doteraz používanému a už nedostupnému DCDR povrchu - doštičkám SpectRIM TM od firmy Tienta Sciences,Inc. Z testovaných povr- chov sa ako najvhodnejší na d'alšie použitie javí sklíčko fluoridu vápenatého (CaF2). Signál z ostatných povrchov bol príliš slabý, alebo boli v spektrách pozorované spektrálne pásy nepríslušiace lipidu.
|
|
|
Cytoplasmic membrane of Bacillus subtilis Regulation of the physical parameters
Beranová, Jana ; Konopásek, Ivo (vedoucí práce) ; Branny, Pavel (oponent) ; Holoubek, Aleš (oponent)
Bacillus subtilis, modelová Gram-pozitivní bakterie, uplatňuje při adaptaci své membrány k nízkým teplotám dva odlišné mechanismy: 1) Při dlouhodobé adaptaci k nižším teplotám dochází ke zvýšení poměru anteiso/iso-větvených mastných kyselin v membránových lipidech. 2) Po náhlém poklesu teploty je indukována syntéza desaturázy (Des), proteinu, který v aerobních podmínkách desaturuje řetězce mastných kyselin v lipidech cytoplazmatické membrány. Transkripce genu des, kódujícího desaturázu mastných kyselin, je indukována zvýšením uspořádanosti membrány. Pro indukci transkripce genu des je nezbytná účast dvoukomponentového systému DesK-DesR. V této práci jsem sledovala, jak kultivační podmínky ovlivňují mechanismus adaptace membrány B. subtilis k nízkým teplotám. Použity byly metody fluorescenční spektroskopie, analýza mastných kyselin, diferenciální skenovací kalorimetrie a metody molekulární biologie. V první části práce jsem se zabývala vlivem složení kultivačního media na chemické složení a biofyzikální parametry cytoplazmatické membrány B. subtilis během růstu v optimální (40 řC) a suboptimální (20 řC) teplotě. Srovnávala jsem komplexní medium s glukózou bohaté na živiny a dvě média minerální obsahující buď glukózu nebo glycerol jako zdroj uhlíku. Získaná data jasně ukazují zásadní vliv složení...
|
|
| |
|
|
Regulace vnitřního pH kvasinek - vliv vybraných transportních proteinů
Zalom, Peter ; Chaloupka, Roman (vedoucí práce) ; Holoubek, Aleš (oponent)
Intracelulární pH ovlivňuje téměř všechny biochemické procesy v kvasinkách. Regulace cytosolického pH zahrnuje funkci mnoha transportních proteinů. Vliv vybraných sodných transportérů na cytosolcké pH byl zkoumán u dvou druhů kvasinek: Saccharomyces cerevisiae a Zygosaccharomyces rouxii včetně divokých kmenů a mutantů s ovlyvněným transportem sodíku. Měření cytosolického pH a pufrační kapacity bylo provedeno za použití fluorescenční sondy pHluorin - pH citlivého derivátu zeleného fluorescenčního proteínu. Bylo porovnáno několik postupů pro kalibraci fluorescenční odezvy pHluorinu na cytozolické pH. Byla prokázána důležitost korekce pro získaní správnych kalibračních křivkek . Bylo zjisteno, že cytosolické pH je ovlivněno transportním proteinem Nha1 jak v S. cerevisiae tak i v Z. Rouxii, ale ne transportérem Sod2-22 přítomným v Z. rouxii. Bylo prokázáno, že pufrační kapacita cytosolu klesá v přítomnosti glukózy ve všech studovaných kmenech.
|
|
| |
|
|
Studium průniku oligonukleotidů skrz liposomální membránu
Nováková, Jana ; Kočišová, Eva (vedoucí práce) ; Holoubek, Aleš (oponent)
Modifikované oligonukleotidy, krátké úseky nukleové kyseliny, se staly potenciálními léčivy virových, nádorových či geneticky podmíněných onemocnění. Účinné použití modifikovaných oligonukleotidů vyžaduje jejich efektivní průnik skrz buněčnou membránu dovnitř buňky. V diplomové práci byly využívány liposomy, syntetické váčky tvořené dvojitou lipidovou vrstvou, jako modelový systém ke studiu interakce lipidu s komplexem homooligonukleotidu dT15 a kationického porfyrinu CuTMPyP4 za použití Ramanovy spektroskopie. Měření Ramanových spekter bylo prováděno na integrovaném Ramanově konfokálním mikrospektrofotometru a to jednak z roztoku na podložním sklíčku a jednak za použití speciální techniky kapkově nanášených povlaků (DCDR). Byl optimalizován proces výroby liposomů a přípravy vzorků pro měření spekter. Experimentální data byla zpracována faktorovou analýzou za využití algoritmu SVD (singular value decomposition). Bylo pozorováno, že při interakci oligonukleotidu s porfyrinem dochází k nárůstu signálu způsobeného fluorescencí. V naměřených Ramanových spektrech komplexu oligonukleotidu s porfyrinem dominují pásy, které přísluší vibracím porfyrinu. Ve spektrech komplexu s liposomy je možné pozorovat příspěvek valenčních vibrací vodíků řetězců mastných kyselin lipidu. Pozorované spektrální změny ukazují na...
|
host ::
RSS.