|
|
Bordetella Adenylate Cyclase: Molecular mechanism of Action and Its Use for Antigen Delivery
Kamanová, Jana ; Šebo, Peter (vedoucí práce) ; Dráber, Petr (oponent) ; Černý, Jan (oponent)
(Czech) 6 SUMMARY (Czech) První část této dizertační práce se věnuje molekulárnímu mechanismu působení adenylát-cyklázového toxinu (CyaA). Tento protein z rodiny RTX toxinů je sekretovaný gramnegativní bakterií Bordetella pertussis, která způsobuje infekční onemocnění nazývané černý kašel. CyaA hraje klíčovou roli ve schopnosti tohoto patogena kolonizovat sliznice horních cest dýchacích a to díky schopnosti potlačovat baktericidní funkce myeloidních fagocytujících buněk imunitního systému hostitele. CyaA se váže na integrin CD11b/CD18 (označovaný také jako CR3 nebo αMβ2) těchto buněk, vytváří v jejich buněčných membránách malé kation-selektivní kanály, a dopravuje do jejich cytozolu N-koncovou adenylát- cyklázovou (AC) doménu. Ta je po svém průniku do buněčného cytozolu aktivována navázáním eukaryotického kalmodulinu a katalyzuje velmi efektivní přeměnu ATP na cAMP, jednu z klíčových molekul buněčné signalizace. Tím dochází v napadených buňkách k nárůstu hladiny cAMP, což vyvolá rychlou ztrátu schopností fagocytózy pomocí Fc-receptorů a oxidativního vzplanutí těchto buněk. CyaA má unikátní schopnost přenášet svou AC doménu do cytozolu buněk přímo z cytoplazmatické membrány. Celý proces je velmi pravděpodobně poháněn membránovým potenciálem, a vyžaduje strukturní integritu a kooperaci všech domén RTX...
|
|
|
Interakce adenylát cyklasového toxinu s komplementovým receptorem 3 - vztah struktury a funkce
Morová, Jana ; Šebo, Peter (vedoucí práce) ; Konvalinka, Jan (oponent) ; Bezouška, Karel (oponent)
4 ZÁvĚnv Pnoorrxcp rNrEGRrNu CDI t b/CDl g METoDoU WESTERN BLoT pro imunizaci myšía přípravu specifických protilátek. podjednotky CDllb, tak 52 buňky nejsou schopny účinnětransponovat tuto pod.|ednotku na svůjpovrch nebo sekretovatjejí extracelu|ární doménu do média. A to ani v případě, žeje opatřena signálním peptidem specifickým pro tyto buňky. Dále bylo prokázáno, Že pouŽití plasmidů pro konstitutivní nebo inducibilní expresi proteinů nemá vliv na hladinu exprese podjednotky CD l 8. Analysn NTERAKCE RTX roxlNŮ . p, INTEGR|NY _ RoLE GLYKoSYLACE RrcepronŮ vr,vaznři, RTX roxtNťi vyŽaduje glykosylaci integrinového receptoru CDl lb/CDl8' A zároveň bylo ukázáno, Že sniŽení vazby CyaA po odstranění sacharidovéhých řetězců není zpŮsobeno niŽším mnoŽstvím integrinu CDt lb/CDl8 na buněčnémpovrchu nebo jeho rozpadem na .jednotlivé podjednotky CD l t b a CDl 8. sacharidy - chitobiosou' chitotriosou. D-mannosou, N-aceýl|aktosaminem a sia1ovou kyselinou - sacharidy, které jsou obsaženy v N-glykosidicky vázaném oligosacgaridovém řetězci. To ukazu.je na lektinovou aktivitu CyaA. receptoru CD I l b/CD l8, která urču.je vazbu CyaA. aktivitě da|šíchRTX toxinů. l5 IMUNoLoG|CKÉ vYUŽlTí CyaA .lnxo NostČr, PRo DoPRAvtl MYKoBAKrnRIÁI-nicg EPIToPŮ Do ANT|GEN PREZENTI)JÍCicH sttNĚx epitop oVA:257.264 (pozice l08) na molekulách...
|
|
|
Regulační úlohy proteinů PAG a CSK v FcɛRI signalizaci žírných buněk
Potůčková, Lucie ; Dráber, Petr (vedoucí práce) ; Šebo, Peter (oponent) ; Holáň, Vladimír (oponent)
9 2 ABSTRAKT (CZ) Tato disertační práce je zaměřena především na pochopení regulační úlohy C- terminální Src kinázy (CSK) a proteinu asociovaného s mikrodoménami bohatými na glykosfingolipidy (PAG) v FcɛRI zprostředkované signalizaci myších žírných buněk. FcɛRI aktivace je zahájena agregací receptoru komplexem multivalentního antigenu s IgE a následnou aktivací protein tyrozin kináz, protein tyrozin fosfatáz a dalších molekul signální transdukce. Signalizační děje vedou k degranulaci žírných buněk a uvolnění prozánětlivých mediátorů zodpovědných za vznik alergických onemocnění. Poznání funkce klíčových regulačních molekul, které kontrolují FcɛRI zprostředkovanou aktivaci, degranulaci a cytokinovou produkci žírných buněk, může mít terapeutický dopad. CSK je hlavním negativním regulátorem protein tyrozin kináz z rodiny Src (SFK), které hrají kritickou úlohu v různých imunoreceptorových dějích. Funkce CSK v žírných buňkách však není zcela objasněna. Předpokládá se, že CSK lokalizovaná v cytoplazmě je translokována do blízkosti membránově vázaných SFK s využitím membránových adaptorových proteinů a PAG byl hlavním kandidátem. Pro určení úlohy proteinů CSK a PAG v FcɛRI signalizaci jsme jako model použili žírné buňky odvozené z kostní dřeně (BMMC) myší divokého typu nebo myší deficientních v proteinu PAG...
|
|
|
Mechanism of action of adenylate cyclase toxin on immune function of dendritic cells
Švédová, Martina ; Šebo, Peter (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent) ; Stulík, Jiří (oponent)
Adenylátcyklázový toxin (CyaA) je klíčovým faktorem virulence bakterie Bordetella pertusis, která je původcem černého kašle. CyaA se váže na fagocyty, které exprimují na svém povrchu komplementový receptor 3 a poté katalyzuje rychlou přeměnu ATP na cAMP, které rozvrací buněčnou signalizaci. Zároveň CyaA tvoří uvnitř buněčné membrány kation-selektivní póry, které zapříčiňují únik draslíku z buněčného cytosolu. Enzymaticky neaktivní forma CyaA toxinu, adenylátcyklázový toxoid (CyaA-AC- ), se používá jako nástroj pro dopravu antigenů již 20 let. Tato práce se zaměřila především na studium mechanismu působení CyaA toxoidu a toxinu. Zkoumali jsme adjuvantní účinky CyaA toxoidu, jeho kapacitu nořit se do buněčné membrány a možnost jeho využití pro dopravu epitopů z chřipkového viru. Ukázali jsme, že pórotvorná aktivita toxoidu a následná aktivace MAP kináz JNK a p38 jsou klíčové pro adjuvantní účinek toxoidu CyaA-AC- a způsobují maturaci dendritických buněk (DC - z angl. dendritic cells), nezávislou na signalizaci TLR (z angl. Toll-like receptor) drah a inflamazómu. K stimulaci dendritických buněk dochází dokonce i in vivo a toxoidem aktivované DC jsou pak schopné navodit CD8+ a CD4+ T buněčné odpovědi in vitro a in vivo. Dále jsme ukázali, že prvních 371 aminokyselin je postradatelných pro schopnost...
|
|
|
Studium patogeneze infekce, kterou způsobují bakterie komplexu Burkholderia cepacia u nemocných cystickou fibrózou
Kalferstová, Lucie ; Dřevínek, Pavel (vedoucí práce) ; Kolář, Milan (oponent) ; Šebo, Peter (oponent)
Souhrn: Bakterie komplexu Burkholderia cepacia (Bcc) a bakterie Pseudomonas aeruginosa patří mezi nejzávažnější patogeny způsobující plicní infekce u pacientů s cystickou fibrózou (CF). Tyto bakterie jsou vysoce rezistentní k téměř všem dostupným antibiotikům. Kromě problematické léčby je dalším závažným problémem riziko vzniku epidemické infekce, které je dané schopností některých kmenů šířit se mezi pacienty. Některé kmeny bakterií Bcc jsou schopny přejít do krevního řečiště a způsobit závažný septický stav zvaný cepacia syndrom. Jedním z takových kmenů je český epidemický kmen B. cenocepacia ST32, který se v 90. letech 20. století rozšířil mezi českými pacienty s CF. Cílem této práce bylo porovnat transkriptomový profil izolátů získaných z krve pacientů ve fázi cepacia syndromu s profilem izolátů získaných ze sputa pacientů ve stabilní fázi infekce, případně v exacerbaci. Na základě porovnání vybrat vhodné geny s rozdílnou expresí, které by mohly být využity jako případný marker pro detekci blížícího se cepacia syndromu. Vybraný vhodný "marker", který by měl zároveň kódovat obecně známý faktor virulence, podrobit hlubšímu studium pro porozumění jeho funkce a vlivu na virulenci v okamžiku cepacia syndromu. Posledním cílem této práce bylo zhodnocení epidemiologické situace bakterií P. aeruginosa u pacientů...
|
|
|
Signaling effects of adenylate cyclase toxin action on phagocytes
Černý, Ondřej ; Šebo, Peter (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent) ; Dráber, Petr (oponent)
Adenylát-cyklázový toxin (CyaA) je klíčovým faktorem virulence bakterie Bordetella pertussis. CyaA se váže na fagocyty produkující komplementový receptor 3 (CR3) a následně katalyzuje přeměnu vnitrobuněčného ATP na významného "druhého posla" cAMP. Tímto paralyzuje schopnost neutrofilů a makrofágů zabíjet bakterie pomocí oxidativního vzplanutí a mechanismů závislých na fagocytóze. V této práci analyzujeme mechanismus, kterým CyaA blokuje produkci baktericidních reaktivních kyslíkových a dusíkových radikálů neutrofily a makrofágy. CyaA potlačuje produkci reaktivních kyslíkových radikálů (ROS, z angl. "reactive oxygen species") jednak prostřednictvím inhibice PLC přes PKA a dále nejspíše ovlivněním skládání komplexu NADPH oxidázy prostřednictvím aktivace proteinu Epac. Selektivní aktivace PKA nebo Epac blokovala produkci ROS indukovanou fMLP. Inhibice PKA pomocí specifických inhibitorů navíc vedla jen k částečnému obnovení produkce ROS u neutrofilů vystavených CyaA. Signalizace CyaA/cAMP následně omezila tvorbu DAG, zatímco tvorba PIP3 zůstala neovlivněna. Tyto výsledky naznačují, že působení CyaA může ovlivnit lipidické složení membrány fagocytů. Dále jsme ukázali, že aktivace PKA pomocí cAMP vyvolává aktivaci tyrozínové fosfatázy SHP-1. To v makrofázích způsobí potlačení produkce reaktivních...
|
|
|
Vztah struktury a funkce a využití RTX proteinů gramnegativních bakterií
Sadílková, Lenka ; Šebo, Peter (vedoucí práce) ; Stulík, Jiří (oponent) ; Weiser, Jaroslav (oponent)
Označení RTX (Repeat in ToXin) spojuje početnou a stále se rozrůstající skupinu proteinů rozličných funkcí. Pro všechny její členy, mezi něž se řadí například toxiny, metaloproteasy, lipasy, proteiny S-vrstvy, bakteriociny a proteiny s dosud neobjasněnou funkcí, jsou typické následující charakteristiky: i) přítomnost nonapeptidové a na glycin bohaté vápník-vazebné konsensus sekvence GGXGXDX[L/I/V/W/Y/F]X (kde X může být jakýkoliv aminokyselinový zbytek) v různém počtu opakování (6-50) v C-koncové části proteinu; ii) k sekreci proteinu z buňky dochází bez přítomnosti periplasmatického intermediátu mechanismem zahrnujícím rozpoznání C-koncového sekrečního signálu proteiny asociovanými s cytoplasmatickou membránou, které následně exportují protein do kanálu procházejícího skrze celou bakteriální buněčnou stěnu ven z buňky (sekreční systém typu I); iii) geny pro syntézu strukturního proteinu, jeho aktivaci a sekreci jsou většinou uskupeny v tzv. RTX operonu. Nejrozsáhlejší skupinu rodiny RTX proteinů tvoří RTX toxiny. Většinou se jedná o proteiny o molekulové hmotnosti mezi 100-200 kDa, posttranslačně modifikované acylací mastnou kyselinou. Acylace je zprostředkována specifickým aktivačním proteinem. Tato posttranslační modifikace je naprosto nezbytná pro aktivaci molekuly toxinu a jeho funkci a...
|
|
|
Topografie signalizačních molekul na plazmatické membráně při aktivaci žírných buněk
Lebduška, Pavel ; Dráber, Petr (vedoucí práce) ; Šebo, Peter (oponent) ; Benada, Oldřich (oponent) ; Tučková, Ludmila (oponent)
|išitmezirůznýmimodeloými zástupcidanéhobuněčnéhotypu.Prezentovaná metodaizolacemembriínoýchlistuz neadherentníchbuněkby mohlavýzkum v tomtooboruusnadnit.Je všaktřebapřipomenout,Žeplastickéhoobrazuo přenosu signálupřesp|azmatickoumembrá'nujemožnodosáhnoutjensouhrouřady rozdilnýchavzájemněse doplňujícíchpřístupů. Závérv By|y vytvořeny tři způsobyizolacemembránových|istůz neadherentních žírnýchbuněk BMMC. Jedenz nich,založenýna adsorpci leukocytů ke sk|eněnémupovrchu,seukázal být zvláštěslibný a poskyt|řadu vědeckých dzt (čIánekE"). Aktivace žírnýchbuněk RBL dimerizacíreceptoruFceRI vedla k obohacení plazmatickémembrány o adaptoroý protein Grb2, který však'na rozdí| od případumultimerizacer€ceptoru' s FcaRI signiíikantněneko|oka|izoval a distribuceFceRI neby|ametodouimunoznačenímembránových|istů odlišitelnáod distribuce na neaktivovanýchbuňkách (čtánekA).Žírnébuňky BMMC' na rozdí|od buněk RBL' netvořily po mu|timerizacireceptoruvětší agregátyFceRI, nežbuňky neaktivované.Mu|timerizace receptoruFcaRI vedla u buněk BMMC a RBL k jeho internalizaci o srovnate|néintenzitěi celkové dynamice,ale lolcilní redistribuceFceRI se u nich zásadně|iši|a(článekE). Vžifýmode|rozsáhlých (přib|ižně200nm) signalizačníchdoméntohoto receptorubyl zpochybněn. Adaptorový protein NTAL by| v p|azmatickémembráně distribuován v...
|
|
| |
|
| |
host ::
RSS.