|
|
Molekulárně biologická charakterizace vybraných producentů PHA
Kubáčková, Eliška ; Brázda, Václav (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Diplomová práce se zabývá molekulárně biologickou charakterizací vybraných producentů polyhydroxyalkanoátů (PHA). V rámci práce byly pomocí molekulárně biologických metod identifikovány a charakterizovány PHA produkující termofilní izoláty pocházející ze vzorků aktivovaného kalu a kompostu. Sekvenací 16S rRNA genu byly termofilní izoláty identifikovány a taxonomicky zařazeny do kmene bakterií Firmicutes. U těchto bakteriálních izolátů byla stanovena schopnost produkce PHA na úrovni genotypu pomocí konvenční PCR detekcí phaC genu kódujícího PHA syntázu, který je klíčovým enzymem biosyntézy PHA. U většiny izolovaných bakterií byly detekovány PHA syntázy I., II. a IV. třídy, přičemž PHA syntázy tříd I a II nejsou pro detekované rody bakterií charakteristické. Největšího zastoupení izolátů představoval druh termofilní bakterie Aneurinibacillus thermoaerophilus, u kterého byla detekována PHA syntáza IV. třídy. V druhé části diplomové práce byla zavedena metoda RT-qPCR pro studium exprese vybraných genů bakterie Cupriavidus necator H16 zapojených do metabolismu PHA. V rámci zavedení metody byla provedena optimalizace PCR detekce vybraných genů a optimalizována kvantifikace genů pomocí real-time PCR. Testovaná metoda zahrnovala kroky izolace RNA, syntézu cDNA a kvantifikaci úseků genů, u nichž byly na základě získaných dat stanoveny kritické body metody.
|
|
|
Studium exprese genů u bakterie Cupriavidus necator a dalších vybraných producentů polyhydroxyalkanoátů
Centnerová, Radmila ; Šedrlová, Zuzana (oponent) ; Pernicová, Iva (vedoucí práce)
Bakalářská práce se zabývá studiem exprese genů bakterie Cupriavidus necator H16, která je známa jako modelový organismus metabolismu polyhydroxyalkanoátů. V první části této práce byla provedena optimalizace metodiky RT-qPCR, jež byla posléze použita pro studium genové exprese. Dále byly porovnávány různé komerční kity pro izolaci genomické DNA, izolaci RNA, a pro reverzní transkripci a vznik komplementární DNA. Z dostupných kitů byl vybrán ten, se kterým bylo dosaženo nejrelevantnějších výsledků a zároveň byla snadná a bezpečná práce. Při izolaci bylo dosaženo rozdílných výtěžků pro jednotlivé kity, použitý kit má tak velmi významný vliv na kvalitu získané nukleové kyseliny a tím i na úspěšnost celého měření. Izolovaná genomická DNA byla použita pro účely optimalizace a kalibrace. Izolovaná RNA a komplementární DNA byly použity ve druhé části práce, ve které byla studovaná bakterie kultivována na různých uhlíkatých substrátech. Poté bylo pomocí optimalizované RT-qPCR metodiky provedeno studium exprese vybraných genů zapojených do biosyntézy polyhydroxyalkanoátů. Významnější změny v genové expresi byly obecně zaznamenány tehdy, když byla jako uhlíkatý substrát použita fruktóza oproti tomu, když byl použit -butyrolakton. Největší nárůst exprese genů byl při kultivaci na fruktóze zaznamenán pro gen, kterým je kódována 4-hydroxyfenylacetát-3-hydroxyláza. Při kultivaci na -butyrolaktonu byly významnější změny v expresi pozorovány pouze pro gen kódující 4-hydroxybutyrát dehydrogenázu. Výběr substrátu má tedy zásadní vliv na genovou expresi.
|
|
|
Potenciální vliv tkáňově specifických transkripčních faktorů na expresi metalothioneinů
Michálková, Nikola
Metalothioneiny představují skupinou intracelulárních proteinů, které jsou schopné vázat kovové ionty a jejich funkce zahrnuje regulaci buněčných hladin těchto kovových iontů. Transkripční faktory jsou centrálními regulátory genové exprese a hrají důležitou roli v regulaci genové exprese metalothioneinů, která představuje základní mechanismus pro buněčnou odpověď na změny hladin kovových iontů. Ačkoli jsou známy transkripční faktory, které se vážou na oblasti promotoru metalothioneinů, jejich role při bazální a indukované genové expresi metalothioneinů není zcela objasněna. Předmětem této diplomové práce byla indukce genové exprese metalothioneinů pomocí zinečnatých iontů u buněčných nádorových linií HUH7 (hepatocelulární karcinom) a T47D (karcinom prsu), a následná analýza genové exprese vybraných transkripčních faktorů. Volba transkripčních faktorů byla provedena na základě analýzy TF ChIP-seq dat z databáze ENCODE. Pro experimentální část byly zvoleny transkripční faktory FOXA1, FOXA2, HNF4A, a HNF4G, jejichž vysoké hladiny jsou typické pro jaterní tkáň. Dále byla sledována genová exprese ubikvitárních transkripčních faktorů JUND, NR3C1, RXRA, STAT3, SP1 a MTF1. Statisticky signifikantní změny v genové expresi (RT-qPCR) po krátkodobé expozici (4-6 h) 100 μM ZnSO4 byly pozorovány u FOXA1, JUND a MTF1. V případě FOXA1 byl u obou nádorových linií sledován pokles genové exprese v porovnání s kontrolou, u JUND a MTF1 naopak nárůst exprese po aplikaci ZnSO4. V případě MTF1 byl pozorován signifikantní narůst pouze u nádorové linie HUH7. Výsledky naznačují, že vedle validovaného zinek-responzivního transkripčního faktoru MTF1, by se mohly podílet na regulaci genové exprese metalothioneinů i transkripční faktory FOXA1 a JUND. FOXA1 by mohl představovat potenciální represor a JUND induktor exprese metalothioneinů v reakci na zvýšenou expozici zinečnatým iontům.
|
|
|
Post-transcriptional regulation of TbIF1 in life cycle of Trypanosoma brucei
GRATZL, Sascha
TbIF1, a protein Inhibitor of F1-ATPase in Trypanosoma brucei, is expressed exclusively in the insect stage of the parasite. In the bloodstream form, TbIF1 is switched off, because its activity interferes with the essential role of the ATP synthase in the maintenance of the mitochondrial membrane potential. Here, we employ a series of reporter genes to study the impact of 3'UTR of TbIF1 on mRNA stability and translatability to get insight into the tight post-transcriptional control of TbIF1. We provide evidence that developmentally regulated RNA binding protein Rbp10 is critical for downregulation of TbIF1 on translation level in bloodstream-form trypanosomes.
|
|
|
Studium exprese genů u bakterie Cupriavidus necator a dalších vybraných producentů polyhydroxyalkanoátů
Centnerová, Radmila ; Šedrlová, Zuzana (oponent) ; Pernicová, Iva (vedoucí práce)
Bakalářská práce se zabývá studiem exprese genů bakterie Cupriavidus necator H16, která je známa jako modelový organismus metabolismu polyhydroxyalkanoátů. V první části této práce byla provedena optimalizace metodiky RT-qPCR, jež byla posléze použita pro studium genové exprese. Dále byly porovnávány různé komerční kity pro izolaci genomické DNA, izolaci RNA, a pro reverzní transkripci a vznik komplementární DNA. Z dostupných kitů byl vybrán ten, se kterým bylo dosaženo nejrelevantnějších výsledků a zároveň byla snadná a bezpečná práce. Při izolaci bylo dosaženo rozdílných výtěžků pro jednotlivé kity, použitý kit má tak velmi významný vliv na kvalitu získané nukleové kyseliny a tím i na úspěšnost celého měření. Izolovaná genomická DNA byla použita pro účely optimalizace a kalibrace. Izolovaná RNA a komplementární DNA byly použity ve druhé části práce, ve které byla studovaná bakterie kultivována na různých uhlíkatých substrátech. Poté bylo pomocí optimalizované RT-qPCR metodiky provedeno studium exprese vybraných genů zapojených do biosyntézy polyhydroxyalkanoátů. Významnější změny v genové expresi byly obecně zaznamenány tehdy, když byla jako uhlíkatý substrát použita fruktóza oproti tomu, když byl použit -butyrolakton. Největší nárůst exprese genů byl při kultivaci na fruktóze zaznamenán pro gen, kterým je kódována 4-hydroxyfenylacetát-3-hydroxyláza. Při kultivaci na -butyrolaktonu byly významnější změny v expresi pozorovány pouze pro gen kódující 4-hydroxybutyrát dehydrogenázu. Výběr substrátu má tedy zásadní vliv na genovou expresi.
|
|
|
Genetické aspekty domestikačního znaku pukavosti lusku u hrachu
Čevelová, Lucie
Cílem diplomové práce je studium genetické podstaty významného domestikačního znaku pukavosti lusku. Analyzovány byly dva druhy hrachu, kulturní hrách s nepukavými lusky JI92 (Pisum sativum subsp. sativum) a planý hrách s pukavými lusky JI64 (Pisum sativum subsp. elatius). Reciprokým křížením těchto dvou linií byly vytvořeny rekombinantní inbrední linie (RILs), z celkových 134 RILs linií bylo vybráno 9 kontrastních linií. V rámci služby jsme využili masivně paralelní sekvenování 3' konců cDNA, získaná reverzní transkripcí mRNA, která byla izolována ze švů lusků. Díky této metodě byly vygenerovány 3 kandidátní geny. Následně jsme zjišťovali expresi těchto tří kandidátních genů pro pukavost pomocí kvantitativní Real-Time PCR (RT-qPCR). Amplifikační křivky a hodnody Ct vygenerované z průběhu RT-qPCR byly následně použity pro vytvoření grafů, které slouží pro zobrazení míry exprese kandidátních genů. Jako nejvhodnější kandidát byl zvolen gen Ps15, který je u hrachu přítomen v LGIII v oblasti Dpo1, a proto by mohl být zodpovědný za pukavost lusku.
|
|
|
Vliv mírného teplotního stresu na expresi genů metabolismu cytokininů a kinetiku růstu klíčních rostlin Arabidopsis thaliana
Truong, Thanh Huong
Vzhledem ke klimatickým změnám, které negativně dopadají na výnosy hospodářsky významných plodin, představuje teplotní stres hrozbu pro udržitelné zemědělství. Studium adaptace a aklimace rostlin vůči zvyšené teplotě proto patří mezi současné výzvy věděckého úsilí. Rostliny jsou během svého života vystaveny různým teplotním podmínkám. Odpověď na nepříznivé teploty zahrnuje řadu signálních drah, které regulují mnoho dalších vývojových a buněčných procesů. Koordinace vývojových procesů za podmínek zvýšené teploty nebo jiných vnějších faktorů je primárně řízena rostlinnými hormony. Tato práce se věnovala studiu interakce mírně zvýšené teploty (29 °C) a rostlinných hormonů cytokininů u modelové rostliny Arabidopsis thaliana. Pro sledování vlivu cytokininů za zvýšené teploty byly provedeny experimenty sledující morfologii rostlin, kinetiku růstu, genovou expresi a kvantifikaci cytokininů. Sledováním elongace embryonálního stonku (hypokotylu), která představuje charakteristickou odpověď rostlin na zvýšenou teplotu, bylo prokázáno, že cytokininy mají významnou úlohu při regulaci odpovědi na zvýšenou teplotu. Analýzou genové exprese a přímým stanovením hladin endogenních cytokininů jsme zjistili, že hladina cytokininů je snížena v odpovědi na mírně zvýšenou teplotu, což dále ukazuje na význam cytokininů při adaptaci na teplotní stres.
|
|
|
Role cytokininů při teplotou indukovaném přechodu rostlin z vegetativní do generativní fáze
Malých, Veronika
V současnosti se mnoho studií zabývá dopadem klimatických změn na rostlinnou produkci. Odpověď rostlin na zvýšenou teplotu zahrnuje elongaci děložního stonku a řapíků, hyponastii listů, změny v nástupu kvetení, a dokonce i potlačení vývoje květů, což může vést ke snížení výnosu plodin. Aklimatizace a odpověď na stresové podněty jsou společně regulovány hladinami rostlinných hormonů, jako jsou auxiny, gibereliny, brassinosteroidy a cytokininy. Přestože cytokininy hrají významnou roli při fyziologických i vývojových procesech, interakce teploty a cytokininů v regulaci vývoje a růstu rostlin nebyla prozatím dostatečně prozkoumána. Tato práce se zabývá účinkem cytokininů na morfologii a nástup kvetení u modelové rostliny Arabidopsis thaliana, a to při mírně zvýšené teplotě za podmínek dlouhého dne. Bylo zjištěno, že při modulaci hladiny cytokininů dochází k redukci rostlinné biomasy a plochy listové růžice, přičemž rozsah tohoto účinku závisí na teplotě. Rovněž bylo potvrzeno, že interakce cytokininů a teploty hraje významnou roli v přechodu rostlin do generativní fáze vývoje rostlin.
|
|
|
Molekulárně biologická charakterizace vybraných producentů PHA
Kubáčková, Eliška ; Brázda, Václav (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Diplomová práce se zabývá molekulárně biologickou charakterizací vybraných producentů polyhydroxyalkanoátů (PHA). V rámci práce byly pomocí molekulárně biologických metod identifikovány a charakterizovány PHA produkující termofilní izoláty pocházející ze vzorků aktivovaného kalu a kompostu. Sekvenací 16S rRNA genu byly termofilní izoláty identifikovány a taxonomicky zařazeny do kmene bakterií Firmicutes. U těchto bakteriálních izolátů byla stanovena schopnost produkce PHA na úrovni genotypu pomocí konvenční PCR detekcí phaC genu kódujícího PHA syntázu, který je klíčovým enzymem biosyntézy PHA. U většiny izolovaných bakterií byly detekovány PHA syntázy I., II. a IV. třídy, přičemž PHA syntázy tříd I a II nejsou pro detekované rody bakterií charakteristické. Největšího zastoupení izolátů představoval druh termofilní bakterie Aneurinibacillus thermoaerophilus, u kterého byla detekována PHA syntáza IV. třídy. V druhé části diplomové práce byla zavedena metoda RT-qPCR pro studium exprese vybraných genů bakterie Cupriavidus necator H16 zapojených do metabolismu PHA. V rámci zavedení metody byla provedena optimalizace PCR detekce vybraných genů a optimalizována kvantifikace genů pomocí real-time PCR. Testovaná metoda zahrnovala kroky izolace RNA, syntézu cDNA a kvantifikaci úseků genů, u nichž byly na základě získaných dat stanoveny kritické body metody.
|
|
|
Porovnání metod izolací dvouvláknové RNA z rostlinného pletiva se zaměřením na výtěžnost virové frakce
MATYÁŠOVÁ, Alena
Pro diagnostiku rostlinných patogenů lze využít masivně paralelní sekvenování (HTS), které má výhodu v sekvenčně nespecifickém zachycení sekvencí všech přítomných organismů ve vzorku. Vstupní materiál lze připravit více metodami podle účelu použití. Cílem této práce je porovnat kvalitativní a kvantitativní profil dvou metod pro izolaci RNA z rostlinného pletiva s obohacením o dvouvláknové frakce za účelem zvýšení množství virových RNA vůči RNA hostitelské rostliny. Srovnávanými metodami jsou běžně využívaná afinní celulózní chromatografie a diferenciální centrifugace s LiCl. Jako výzkumný soubor byla použita rostlina jetele lučního (Trifolium pratense L.) infikovaná viry s jednovláknovými a dvouvláknovými RNA genomy. Tyto viry byly v rostlině v minulosti detekovány pomocí HTS. Testovanými metodami byly z rostliny extrahovány ribonukleové kyseliny. Pomocí metody RT-PCR byly amplifikovány specifické fragmenty osmi virů a po vyhodnocení gelové elektroforézy byl porovnán kvalitativní profil obou metod. Pro porovnání kvantitativního profilu byly vybrány tři viry s různými druhy RNA genomů. Metodou RT-qPCR byla provedena jejich relativní kvantifikace. S využitím softwaru Bio-rad CFX Manager 3.1 byla vyhodnocena normalizovaná exprese jednotlivých virů k 26S ribozomální RNA jako referenční kontrole. Pomocí obou porovnávaných metod byla detekována přítomnost všech testovaných virů. Po vyhodnocení kvantifikačních dat a provedení statistických testů (F-test, T-test) s hladinou významnosti = 0,05 bylo shledáno, že mezi metodou afinní celulózní chromatografie a metodou s diferenciální centrifugací s LiCl není signifikantní rozdíl.
|
host ::
RSS.