|
|
Vnitřní terminace transkripce vícepodjednotkových RNA polymeráz
Vojáčková, Jitka ; Sýkora, Michal (vedoucí práce) ; Kuthan, Martin (oponent)
Transkripce je proces, při kterém dochází k přepisu genetické informace z DNA sekvence do RNA kopie pomocí DNA dependentní RNA polymerázy. U bakterií jsou známy dva způsoby terminace transkripce: vnitřní terminace transkripce, která nevyžaduje žádné další přídatné faktory, a terminace závislá na proteinovém faktoru Rho. Vnitřní terminace transkripce je běžná hlavně u bakterií, ale odlišné, i když částečně podobné formy vnitřní terminace transkripce se vyskytují i u eukaryot a archea. Tato práce udává stručný přehled struktury RNA polymerázy a stability elongačního komplexu, popisuje jednotlivé kroky mechanismu vnitřní terminace transkripce u bakterií včetně jejich dnes diskutovaných modelů a udává příklady vnitřní terminace transkripce u eukaryot a archea a jejich porovnání s bakteriálním mechanismem vnitřní terminace transkripce. Klíčová slova: RNA polymeráza, elongační komplex, vnitřní terminace transkripce, vlásenkové RNA struktury
|
|
|
Doménová struktura a funkce primárních faktorů sigma u bakterií
Kálalová, Debora ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Roučová, Kristina (oponent)
Iniciace transkripce patří ke stěžejním krokům genové exprese. Přepis genetické informace z DNA do RNA zajišťuje vícepodjednotkový enzym RNA polymeráza (RNAP). Avšak samotná RNAP není schopná rozpoznat specifický promotor a iniciovat transkripci. K tomuto účelu slouží bakteriím protein zvaný faktor σ, který se na RNAP váže a spolu tvoří holoenzym RNAP. V této práci popisuji mechanismus bakteriální transkripce a dále stavbu, funkci a regulaci faktorů σ. Zaměřuji se hlavně na primární faktory σ u dvou významných modelových druhů, a to u gramnegativní Escherichia coli a grampozitivního Bacillus subtilis. Popisuji je v kontextu s alternativními faktory σ a poukazuji na jejich vzájemné odlišnosti ve struktuře, funkci a regulaci. Klíčová slova: RNA polymeráza, primární faktory σ, transkripce, bakterie, Bacillus subtilis, Escherichia coli
|
|
|
Regulace transkripce faktory sigma u Bacillus subtilis
Benda, Martin ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Seydlová, Gabriela (oponent)
Pro regulaci genové exprese u bakterií je klíčovým enzymem RNA polymeráza (RNAP). RNAP je více-podjednotkový enzym, který pro rozpoznání DNA využívá podjednotky (faktory) σ. Regulace RNAP s hlavním faktorem σ již byla důkladně studována, oproti tomu regulační mechanismy pro RNAP s alternativními faktory σ dosud nebyly systematicky zkoumány. Tato práce se zabývá převážně modelovým organizmem Bacillus subtilis a jeho alternativními faktory σF , σG , σI a σK . Byla studována transkripční iniciace s těmito faktory z hlediska schopnosti transkribovat z různých promotorů, požadavku RNAP na koncentraci iniciačního nukleosidtrifosfátu (iNTP) a interakce RNAP s vybranými proteiny. Pro faktor σF zde byl pomocí transkripcí in vitro objeven promotor regulovaný koncentrací iNTP, u faktoru σI naopak tento regulační mechanismus nalezen nebyl. V případě σG závislé transkripce se nepodařilo regulaci pomocí koncentrace iNTP otestovat, nicméně byl potvrzen v literatuře popsaný pozitivní vliv proteinu YlyA na transkripční aktivitu RNAP obsahující faktor σG ; tento vliv byl nově objeven také pro RNAP s faktorem σF . Dále byla zkoumána možná funkční interakce proteinu HelD s faktorem σK , která však nebyla potvrzena. Konečně pak tato práce přispěla k objasnění vlivu umělých modifikací nukleových bází na transkripci.
|
|
|
Regulation of expression of Ms1, a sRNA from Mycobacterium smegmatis
Páleníková, Petra ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent)
V průběhu růstu musí bakterie čelit různým vlivům prostředí, jako jsou změna teploty, nedostatek živin a jiné. Při adaptaci na nepříznivé podmínky dochází u bakterií k přizpůsobení genové exprese. Jedním typem regulace genové exprese je regulace pomocí malých nekódujících RNA (sRNA). Dobře studovanou bakteriální sRNA je 6S RNA, která se váže na holoenzym RNA polymerázy. Avšak tato RNA byla nalezena jen u některých druhů baterií. Jedním z druhů, které pravděpodobně nemají 6S RNA jsou mykobakterie. Místo toho byla u Mycobacterium smegmatis nalezena jiná malá RNA - Ms1. Ms1 má strukturu podobnou 6S RNA a skutečně byla původně nalezena jako strukturní homolog 6S RNA. Ukázalo se však, že Ms1 se neváže na holoenzym RNA polymerázy, ale váže se na jádro RNA polymerázy. Jedná se proto o malou RNA významně odlišnou od 6S RNA. Tato práce popisuje regulaci exprese Ms1. Z regulační oblasti před genem pro Ms1 byli připraveny promotorové fragmenty různé délky. Tyto fragmenty byly vloženy před reportérový gen lacZ. Aktivita těchto promotorů byla testována v exponenciální, časné a pozdní stacionární fázi růstu a v průběhu stresu. Na základě provedených experimentů byla určena sekvence promotorového jádra a regulační oblasti, do kterých by se mohl vázat transkripční faktor. Aktivita promotoru pro Ms1 se zvýšila při...
|
|
|
Funkce sigma faktorů RNA polymerasy v Corynebacterium glutamicum
Dvořáková, Pavla ; Pátek, Miroslav (vedoucí práce) ; Dvořáček, Lukáš (oponent)
Cílem této práce bylo charakterizovat funkce sigma faktorů bakterie Corynebacterium glutamicum a analyzovat sekvence promotorů rozeznávaných jednotlivými sigma faktory. Faktory sigma (σ) jsou podjednotky RNA polymerasy, které zajišťují rozpoznání sekvence specifické promotorové oblasti genu a umožňují tak zahájit jeho transkripci. Genom C. glutamicum nese geny, které kódují primární sigma faktor σA a šest alternativních sigma faktorů, σB , σC , σD , σE , σH a σM , jejichž exprese se mění v závislosti na růstových podmínkách a v reakci na podněty z okolního prostředí. Regulace exprese genů na úrovni transkripce je jedním z mechanismů adaptace buňky na změny životních podmínek. V závěru práce je sestavena regulační síť sigma faktorů, která je jádrem komplexní regulační sítě řídící všechny děje v buňce C. glutamicum. Klíčová slova: sigma faktor (SF), RNA polymerasa, Corynebacterium glutamicum, transkripce, promotor
|
|
|
RNA polymerase: The "meeting point" of regulatory networks
Wiedermannová, Jana ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Pospíšek, Martin (oponent) ; Valášek, Leoš (oponent)
Bakteriální RNA polymeráza (RNAP) je proteinový komplex nepostradatelný pro přepis DNA do RNA. Jakožto klíčový enzym zodpovědný za regulaci genové exprese shromažďuje signály z buňky a reaguje na ně přesným nastavením úrovně transkripce jednotlivých genů. Tento proces ovlivňují jak vlastní podjednotky RNAP tak i další transkripční faktory (TF), které přímo nebo nepřímo interagují s RNAP. Cílem této disertace bylo prohloubit znalosti o komplexitě transkripční regulační sítě a o provázanosti jejích jednotlivých nitek, které jsou stále objevovány. Hlavním tématem této PhD práce je protein HelD, nově objevený vazebný partner RNAP z bakterie Bacillus subtilis. Ukázali jsme, že HelD se váže mezi sekundární kanál RNA polymerázy a alfa podjednotky tohoto enzymu. HelD se váže na RNAP ve formě jádra (bez přítomnosti sigma faktoru). Dokázali jsme, že HelD stimuluje transkripci v závislosti na ATP tím, že napomáhá jejímu cyklování a elongaci. Stimulační efekt proteinu HelD je násoben působením podjednotky delta, malé podjednotky RNA polymerázy specifické pro gram positivní (G+) bakterie. Tento fakt odhalil nové vztahy v provázanosti komplikované transkripční sítě. Další dvě publikace této práce pojednávají o vlastní delta podjednotce. Pomocí nukleární magnetické rezonance (NMR) jsme vyřešili 3D strukturu a...
|
|
|
Regulace bakteriální transkripce alternativními faktory sigma.
Benda, Martin ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Roučová, Kristina (oponent)
Důležitou vlastností bakterií je jejich schopnost reagovat na rozličné životní podmínky pomocí regulace na úrovni transkripce. Tato práce je zaměřena na regulaci iniciace transkripce pomocí využití různých faktorů sigma. Faktory sigma jsou specifické podjednotky RNA polymerázy, které zajišťují její správné nasednutí na promotorovou oblast genu či operonu. Při exponenciální fázi růstu v ideálních podmínkách buňka přepisuje většinu genů pod kontrolou tzv. housekeeping faktoru. Při přechodu do stacionární fáze, sporulaci či při odpovědi na stresové podmínky jsou však přepisovány geny pod kontrolou alternativních faktorů. Tato práce přináší výčet těchto alternativních faktorů u Bacillus subtilis, zaměřuje se na podmínky, při nichž jsou jednotlivé faktory sigma využívány, metody aktivace a represe aktivity těchto faktorů a jimi kontrolované regulony.
|
|
|
Charakterizace Ms1, nově identifikované malé RNA z Mycobacterium smegmatis
Pospíšil, Jiří ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent)
Úvod: V poslední době stále roste zájem o regulaci genové exprese pomocí malých nekódujících RNA (sRNA). Jako první sRNA byla v 60. letech objevena 6S RNA u E. coli (délka ~184 nt). Trvalo ovšem dalších ~ 30 let než byla pochopena její funkce. 6S RNA se váže během stacionární fáze na RNA polymerázu (RNAP), obsahující faktor σ70 (primární faktor sigma) a tím je zabráněno transkripci ze σ70 - dependentních promotorů. V naší laboratoři byla objevena malá RNA (délka ~300 nt) ve stacionární fázi Mycobacterium smegmatis. Tato sRNA byla následně pojmenována jako Ms 1. Funkce Ms 1 je prozatím neznámá a předchozí experimenty naznačují, že by se mohla vázat na RNAP, neobsahující faktor sigma A. Cíle: Cílem této diplomové práce je přispět k charakterizaci Ms 1. Přístupy: Jako první jsem pomocí klonování, afinitní chromatografie a transkripce in vitro připravil komponenty pro následující experimenty in vitro: RNAP, σA , Ms 1 a její mutované varianty. Dále byly tyto komponenty použity ve vazebných pokusech na nativním gelu a v transkripčních experimentech. Výsledky: Byly připraveny RNAP, σA , Ms 1 a její varianty. In vitro vazebné testy ukázaly, že se wt Ms 1 váže na RNAP, na rozdíl od některých mutovaných Ms 1. Byly tak identifikovány oblasti Ms 1, důležité pro vazbu. Následně byl sestaven aktivní transkripční...
|
|
|
Regulation of transcription in mycobacteria.
Páleníková, Petra ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Mrvová, Silvia (oponent)
Bakteriálna bunka sa musí vedieť rýchlo prispôsobiť zmenám, ktorým je vystavená v prostredí. Na tieto zmeny reaguje reguláciou génovej expresie primárne na úrovni iniciácie transkripcie. Medzi formy reguláciu transkripcie môžeme zaradiť rôznu stavbu promótorových oblastí pred odlišnými skupinami génov, prítomnosť alternatívnych sigma faktorov a tiež ovplyvňovanie priebehu génovej expresie pôsobením transkripčných faktorov buď ako aktivátory, alebo ako inhibítory. V tejto práci sú popísané spôsoby regulácie transkripcie u baktérií rodu Mycobacterium, ku ktorým zahrňujeme aj patogénne baktérie M. tuberculosis a M. leprae. Baktérie tohto rodu vykazujú malú konzervovanosť promótorových oblastí, veľké množstvo sigma faktorov, veľký počet transkripčných faktorov, prítomnosť dvojkomponentových systémov a mnoho, zatiaľ málo preskúmaných, malých regulačných RNA.
|
|
|
Charakterizace proteinu HelD z Bacillus subtilis
Sudzinová, Petra ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent)
ÚVOD: Bakteriální RNA polymeráza (RNAP) je intenzivně studovaný enzym, který je klíčový pro genovou expresi. V Laboratoři molekulární genetiky bakterií byl objeven nový protein, HelD, interagující s RNAP z bakterie Bacillus subtilis - tedy potenciální transkripční faktor. HelD je protein o velikosti cca 90 kDa, který je příbuzný s proteiny helikázové rodiny UvrD/Rep, rozplétajících DNA ve směru 3'-5'. Role proteinu HelD v buňce nicméně ještě není známá a rovněž nebyla dosud studována případná role HelD v transkripci. CÍLE: Cílem této diplomové práce bylo charakterizovat protein HelD. PŘÍSTUPY: Charakterizace HelD probíhala na třech úrovních: (i) bioinformatická analýza in silico byla použita k nalezení homologů proteinu HelD v jiných bakteriálních druzích; (ii) růstové testy in vivo byly použity pro nalezení fenotypu ΔHelD kmene v porovnání s divokým typem a (iii) biochemické experimenty in vitro byly použity k popsání efektu HelD na transkripci a k otestování, zda dokáže HelD vázat a rozplétat DNA. VÝSLEDKY: Bioinformatická analýza in silico ukázala, že protein HelD se vyskytuje u kmene Firmicutes G+ bakterií důležitých pro průmysl i medicínu. Fenotypové růstové testy odkryly, že HelD je protein důležitý pro rychlou adaptaci buňky na změny v prostředí. Biochemické experimenty ukázaly, že HelD...
|
host ::
RSS.