|
|
Detekce nukleových bazí pomocí kapilární elektroforézy
Hendrychová, Kateřina
Kapilární elektroforéza (CE) je jednou z nejvýznamnějších technik používaných k vysoce výkonným separacím v moderní analytické chemii. Mezi její hlavní výhody patří možnost použití různých detekčních technik, rychlost a účinnost separace či reprodukovatelnost. Tyto vlastnosti se využívají při separaci nejrůznějších analytů od anorganických iontů až po nano částice a byly ověřeny i v této bakalářské práci, kde byly pomocí kapilární elektroforézy s UV detektorem separovány základní stavební kameny DNA a RNA – nukleové báze, které slouží jako biomarkery mnoha poruch, onemocnění i jako indikátory bezpečnosti potravin. Bakalářská práce je zaměřena na vývoj a optimalizaci metody k detekci a separaci 5 nukleových bází a purinu. Separace se podařilo docílit použitím 40 mM borátového pufru o pH 9,8 s přídavkem 60 mM SDS jako detergentu, který tvoří micely.
|
|
|
Fluorescenční sondy pro detekci sacharidů a glykovaných proteinů pomocí kapilární elektroforézy
Kozáková, Silvie
Glykovaný albumin (gHSA) a glykovaný hemoglobin (HbA1c) představují významné biomarkery pro určení progrese onemocnění diabetes mellitus. Cílem této diplomové práce bylo vyvinout a optimalizovat metodu pro simultánní stanovení těchto glykovaných proteinů z lidské krve pomocí kapilární elektroforézy s využitím fluorescenční sondy ABAM (anthracene boronic acid methacrylate). Díky této nové metodě bylo možné selektivně stanovit zmíněné dva proteiny s rozlišením 5,70 a LOD 11,9 µg/ml pro gHSA a 26,5 µg/ml pro HbA1c. Následně byla optimalizovaná metoda úspěšně aplikována na reálný vzorek lidské krve. Současné stanovení těchto biomarkerů může pomoci lépe sledovat dynamické změny v průběhu onemocnění a umožnit monitoring diabetu i u jedinců, u kterých je stanovení HbA1c ze zdravotních důvodů (anémie apod.) nevhodné.
|
|
|
Vývoj nové technologie detekce DNA mutací pro využití v onkologické diagnostice
Janoušková, Kristýna ; Minárik, Marek (vedoucí práce) ; Klepárník, Karel (oponent)
Cílem této diplomové práce bylo otestovat novou technologii detekce DNA mutací a optimalizovat parametry související se zavedením nové metody, která tuto technologii využívá, do onkologické diagnostické praxe. Nová metoda spočívá v experimentální modifikaci již používané metody pro detekci somatických mutací v nádorové DNA, která je založena na heteroduplexní analýze a denaturační kapilární elektroforéze. Novým aspektem je využití specifické sondy, krátkého oligonukleotidu, jehož použití výrazně zjednodušuje interpretaci data a nově také umožňuje současné vyšetření více mutací v jedné reakci (multiplexy). Klíčová slova: DNA, denaturační kapilární elektroforéza, heteroduplex, mutace, PCR, sonda
|
|
|
On-line derivatizace sacharidů v kapilární elektroforéze
Mareš, Vít ; Křížek, Tomáš (vedoucí práce) ; Coufal, Pavel (oponent)
Sacharidové řetězce glykoproteinů mohou podléhat různým chybám při jejich bi- osyntéze, které ovlivňují jejich biologické funkce, proto jich může být využito v diagnóze některých onemocnění nebo kontrole kvality biofarmaceutik, konkrét- ně monoklonálních protilátek, které také obsahují tetramerní glykoproteiny. Při diagnóze těchto poruch má potencionální využití kapilární elektroforéza. V této práci byla vyvíjena metoda on-line derivatizace sacharidů v křemenné kapiláře o délce 50 cm a o vnitřním průměru 50 µm. Jako modelová molekula byla použita glukóza, která byla značena fluorescenčním derivatizačním činidlem, 7-aminonaftalen-1,3-disulfonovou kyselinou. Metodu derivatizace glukózy a její separaci bylo potřeba optimalizovat. Nejprve byla zjištěna elektroforetická po- hyblivost derivatizačního činidla v 0,5; 1,0 a 2,5M koncentracích kyseliny octové a v 20mM fosfátovém pufru, pH = 3,5. Jako rozpouštědlo pro 7-aminonaftalen- 1,3-disufonovou kyselinu byly vyzkoušeny 2,5M kyselina octová i 20mM fosfátový pufr se záměrem sjednotit reakční a separační prostředí, což se ukázalo jako ne- realizovatelné. Byly zjištěny efektivní pohyblivosti ve zmíněných roztocích. Nej- lépe probíhala reakce s glukózou v prostředí kyseliny octové. Pro separaci bylo zjištěno, že nejvhodnějším základním elektrolytem je naopak...
|
|
|
Stanovení glutathionu v rostlinných vzorcích pomocí kapilární elektroforézy
Skála, Michael ; Křížek, Tomáš (vedoucí práce) ; Kubíčková, Anna (oponent)
Tato práce vychází z dříve publikované metody pro stanovení obou forem glutathionu pomocí kapilární zónové elektroforézy opatřené UV spektrometrickým detektorem. Teoretická část popisuje biologické a biochemické funkce glutathionu. Dále teoretická část shrnuje historické metody stanovení glutathionu, jejich přesnost, správnost a spolehlivost se speciálním zaměřením na metody elektroforetické, a zvláště pak na kapilární zónovou elektroforézu. Je popsán princip kapilární zónové elektroforézy. Také řeší problematiku různých typů vzorků, speciálně pak rostlinné vzorky. Na závěr uvádí metodu pro stanovení redukované a oxidované formy glutathionu, ze které tato práce vychází. V praktické části je popsán postup vývoje a optimalizace samotné metody. Nejprve bylo testováno složení základního elektrolytu, jeho iontová síla, byly porovnávány dva elektrolyty - s NaCl a bez NaCl, byly pozorovány minimální rozdíly, proto byl NaCl ze základního elektrolytu vyloučen. Dále byla určována optimální koncentrace hexadimethrin bromidu. Byl sledován vliv koncentrace hexadimethrin bromidu na rychlost elektroosmotického toku. Byla sestavena kalibrační křivka pro různé koncentrace analytů ve vodě, byla zjištěna opakovatelnost, LOD a LOQ. Následně byla určována pozice píků v elektroferogramech reálného vzorku extraktu z...
|
|
|
Modifikace vnitřního povrchu kapilár pro elektroforetické separace liposomů
Píplová, Renata ; Křížek, Tomáš (vedoucí práce) ; Čokrtová, Kateřina (oponent)
Elektroosmotický tok je jedním z hlavních faktorů, jež ovlivňují rozlišení separací v kapilární elektroforéze a často je nutná jeho modifikace. Jedním ze způsobů modifikace elektroosmotického toku je dynamické nebo permanentní pokrývání vnitřního povrchu kapiláry. Při separacích liposomů může taková modifikace navíc zmírnit jejich tendenci adsorbovat se na povrch kapiláry. Cílem práce bylo najít stabilní pokrytí, které bude dostatečně eliminovat elektroosmotický tok a otestovat jeho vliv na separace liposomů. Nejprve bylo testováno dynamické pokrytí kapiláry polymery Pluronic F-127, polyvinylpyrrolidon K30, polydialyldimethylamonium chlorid, polyethylenglykol a polyvinyalkohol pomocí čtyř různých metod pokrývání. Jednotlivé polymery a metody se lišily mírou potlačení elektroosmotického toku i stabilitou pokrytí. Z dynamických modifikací byla pro další testování separací liposomů zvolena pokrytí polymery Pluronic F-127, polyvinylpyrrolidon K30 a polydialyldimethylamonium chlorid. Liposomy s fluorescenční značkou byly separovány kapilární elektroforézou s laserem indukovanou fluorescenční detekcí a v jednotlivých pokrytích pak byla určena jejich mobilita. Nejvhodnější pro separace liposomů se jevilo pokrytí polymerem polyvinylpyrrolidon K30, ve kterém docházelo k nejmenším interakcím s liposomy v...
|
|
|
Srovnání detekčních technik pro analýzu sacharidů kapilární elektroforézou
Vlčková, Nikol ; Křížek, Tomáš (vedoucí práce) ; Kozlík, Petr (oponent)
Cílem této práce bylo porovnat detekční techniky kapilární elektroforézy pro stanovení sacharidů. Byly porovnávány bezkontaktní vodivostní detekce, přímá a nepřímá UV detekce a fluorescenční detekce. Sacharidy, které byly stanovovány byly glukóza, sacharóza a fruktóza. Měření s bezkontaktní vodivostní detekcí byla prováděna na kapiláře dlouhé 50 cm s vnitřním průměrem 20 µm. Napětí vložené na kapiláru bylo 15 kV a její teplota byla 25 řC. Jako základní elektrolyt byl použit 40mM NaOH. Kalibrační závislost byla měřena v koncentračním rozmezí 0,005 - 0,5 mg/ml. Opakovatelnost pro plochy píků a migrační časy a výtěžnost byly měřeny ve dvou koncentračních hladinách (0,02 a 0,2 mg/ml). Hodnoty RSD pro opakovatelnosti ploch píků a migračních časů se pohybovaly v rozmezí 0,01 - 8,64 %. Hodnoty pro limity detekce a kvantifikace se pohybovaly v rozmezí 1,0 - 5,8 µg/ml. Odchylky výtěžnosti od skutečné koncentrace analytů se pohybovaly mezi 7 - 22 %. Metody s UV nebo fluorescenční detekcí byly prováděny v kapilárách o vnitřním průměru 50 µm. Při metodě s nepřímou UV detekcí bylo napětí vložené na kapiláru 28 kV a její teplota byla 30 řC. Vlnová délka měření byla 207 nm a jako základní elektrolyt byl použit 50mM glycylglycin o pH 12,8. Kalibrační závislost byla měřena v koncentračním rozmezí 0,1 - 1 mg/ml....
|
|
|
Využití kapilární elektroforézy v analýze suchých krevních skvrn
Ryšavá, Lenka ; Tůma,, Petr (oponent) ; Petr,, Jan (oponent) ; Kubáň, Pavel (vedoucí práce)
Krevní vzorky jsou standardně analyzovány ve formě plazmy nebo séra. Jako alternativa pro vzorkování a skladování krve se stále častěji uplatňují suché krevní skvrny (DBS). V předložené disertační práci jsou DBS zpracovány a analyzovány kapilární elektroforézou (CE), která byla v minulosti pro analýzu DBS využívána velmi zřídka. Nicméně CE nabízí mnohé výhody, dané vývojem této techniky v poslední době, kterými standardní analytické metody nedisponují. Přímé spojení CE s mikroextrakčními technikami a simultánní stanovení analytů přítomných v komplexních matricích vede k minimalizaci nebo eliminaci nedostatků DBS analýz jako jsou například vliv matrice, vliv hematokritu a nehomogenní distribuce analytů v DBS. V nejjednodušším možném uspořádání je dosaženo úpravy, dávkování a analýzy DBS vzorků výhradně komerční CE. Vývojem nových plně rozpustných vzorkovacích materiálů pro DBS je dosaženo lepších extrakčních vlastností a kvantitativních výsledků. Vyvinuté postupy zahrnují nové metody pro účinnou úpravu DBS vzorků a jejich přímou analýzu bez nutnosti zásahu operátora a dosahují dostatečnou selektivitu a citlivost pro stanovení významných analytů nejenom v DBS, ale i v dalších vzorcích se složitými matricemi.
|
|
|
Quantum dots and their interaction with biomolecules
Stanisavljević, Maja
V této práci byly syntetizovány kvantové tečky pomocí mikrovlnné syntézy a povrchově modifikovány různými způsoby pro umožnění interakce s vybranými biomolekulami. Mezi použité konjugační způsoby patří nespecifická interakce, streptavidin-biotin konjugace a vazba pomocí syntetického peptidu. Kvantové tečky pokryté glutathionem o velikosti 2 nm umožnily interakci s velkým žlábkem DNA, zatímco kvantové tečky pokryté streptavidinem specificky interagovaly s biotinylovaným oligonukleotidem. Nakonec, streptavidin-biotin interakce bylo využito i pro vazbu apoferitinu s magnetickými částicemi.
|
|
|
Analytical approaches to study group interactions of azole pesticides with important biological active compounds
Kovač, Ishak ; Jaklová Dytrtová, Jana (vedoucí práce) ; Száková, Jiřina (oponent) ; Navrátil, Tomáš (oponent)
Cílem této disertační práce bylo vyvinout robustní analytickou techniku pro separaci a detekci reziduí triazolových fungicidů (TAF) a také studovat vliv TAF na rostlinu a biologicky aktivní látky. Je zde popsán vývoj metodiky pro stanovení reziduí TAF v reálných vzorcích (rajče "Sweet Cherry" - Solanum lycopersicum L.) pomocí kapilární elektroforézy. Vyvinutá metodika byla validována pro laboratorní použití pří relativně krátké době analýzy a nízkých nákladech na analýzu s dostatečnou mezí detekce a kvantifikace. Další část této disertační práce je zaměřena na vliv TAF na rajče jedlé, jeho růst, fruktifikaci a také vliv na biologicky aktivní látky. Kapilární elektroforéza je analytická technika, vyznačující se při minimální spotřebě vzorku (nL) obecně vysokou účinností při separaci malých molekul. V metodice je využito cyklodextrinem modifikované micelární elektrokinetické chromatografie k separaci směsi TAF získaných ze slupek rajčat. Optimální podmínky pro separaci byly nalezeny v elektrolytu tvořeného kyselinou fosforečnou a Tris (o koncentraci 100 mM), 20% v/v methanolem, se zdánlivým p[H+ ] 4,8. Složkami směsné micelární pseudostacionární fáze byly iontový deter- gent dodecylsulfát sodný (SDS) o koncentraci 15 mM a náhodně sulfátovaný gama- cyklodextrin (17,5 mg/mL). Metodické limity...
|
host ::
RSS.