|
|
Biofyzikální charakterizace proteinového komplexu CAR/RXR s jeho vazebnými partnery
Duchoslav, Vojtěch ; Bouřa, Evžen (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Konstitutivní androstanový receptor (CAR) hraje v organismu významnou roli xenosenzoru, a proto je hojně exprimován v ledvinách, játrech, žlučníku a v epitelu tenkého střeva, kde dochází k biotransformaci xenobiotik. CAR je také důležitým faktorem pro eliminaci žlučových kyselin a bilirubinu. Taktéž se ukázalo, že CAR má významnou roli v regulaci metabolismu glukózy a lipidů. Narušení metabolismu tuků a glukózy je častou příčinou kardiovaskulárních a metabolických onemocnění, jako jsou ateroskleróza, cukrovka druhého typu, obezita a inzulínová rezistence. Tento stav nazýváme metabolickým syndromem a mívá za následek vážné poškození orgánů. Díky schopnosti ovlivňovat metabolismus se CAR, respektive jeho komplex s RXRα (retinoidní X receptor α), stal slibným biologickým cílem pro výzkum potenciálních léčiv metabolického syndromu. Cílem této diplomové práce byla především strukturní charakterizace proteinového komplexu CAR/RXRα spolu s agonistou IV676*HCl, která by detailně popsala interakci této malé molekuly s receptorem. Získané strukturní informace by byly využity při návrhu nových agonistů.
|
|
|
Analogues of IGF-1 for the study of interactions of the hormone with the receptors for IGF-1 and insulin
Macháčková, Kateřina
Insulin a hormony IGF jsou součástí komplexního systému tří navzájem si podobných hormonů (insulinu, IGF-1 a IGF-2) a jejich tří příbuzných receptorů (IR-A, IR-B a IGF-1R). Tento systém hraje důležitou roli v regulaci basální energetické rovnováhy organismu, v jeho růstu, vývoji, délce života, ale i ve vývoji onemocnění jako je diabetes mellitus, rakovina, akromegalie nebo Laronův nanismus. Navzdory strukturním podobnostem má každý hormon svou jedinečnou roli v organismu. Identifikace specifických strukturních motivů v insulinu, IGF-1 a IGF-2, které spouštějí specifické signalizační dráhy, by byla přínosem pro racionální návrh léčiv, pro bezpečnější léčbu diabetu, či účinnější léčbu rakoviny nebo růstových onemocnění. V této práci jsme se zaměřili na identifikaci takových strukturních motivů u hormonu IGF-1. Srovnání dat se studiemi prováděných paralelně s IGF-2 a insulinem by mohlo poskytnout komplexnější pohled na danou problematiku. Nejdříve jsme vyvinuli nezbytné metodologie pro přípravu analogů IGF-1. Vyvinuli jsme nový postup pro celkovou chemickou syntézu analogů IGF-1 založený na syntéze fragmentů IGF-1 na pevné fázi a jejich spojování pomocí cykloadice azidů a alkynů katalyzované ionty CuI . Paralelně jsme vyvinuli postup pro rekombinantní produkci IGF-1 a jeho analogů v E. coli. Abychom...
|
|
|
Increasing affinity of Interferon gamma receptor 1 to Interferon gamma by combining molecular modeling and experimental methods
Mikulecký, Pavel
Téměř ve všech dějích živých buněk hraje interakce mezi proteiny důležitou roli a funkce mnohých proteinů je závislá na jejich specifické interakci s ostatními biomolekulami. Pro vývoj molekul vhodných pro diagnostiku, medicínu a biotechnologie by bylo velmi přínosné, kdybychom měli k dispozici nástroje k ovlivňování interakcí mezi proteiny. Tato práce se zabývala specificitou interakcí mezi proteiny na modelovém příkladu receptoru 1 pro interferon gama (IFNgR1) a jeho přirozeném vazebném ligandu interferonu gama (IFNg), jehož funkce je důležitá pro přirozenou imunitu. Při hledání mutací proteinu IFNgR1, které by měly měnit jeho vazbu (zvýšit nebo snížit) k IFNg, byla použita počítačová in silico analýza dostupných krystalových struktur komplexu mezi IFNgR1 a IFNg. Záměny aminokyselin byly počítačově modelovány a jejich vliv na interakci byl počítán programem FoldX. Všechny varianty receptoru 1, které vyhovovaly kritériím výběru, byly produkovány v bakterii Escherichia coli, dále purifikovány, charakterizovány a jejich interakce byla změřena na přístroji SPR, jenž měří povrchovou rezonanci plazmonů (Surface Plasmon Resonance). První skupina variant IFNgR1 obsahovala mutace na interakčním rozhraní s IFNg. Z SPR měření vyplývá, že většina těchto variant vykazovala stejnou vazbu k IFNg jako nezměněný...
|
|
|
Study of structure and interaction of human lymphocyte receptors
Bláha, Jan
Přirozené zabíječské (Natural killer, NK) buňky jsou důležitou složkou imunitního systému poskytující dohled nad viry infikovanými, stresem transformovanými nebo rakovinnými buňkami. Receptory NKR-P1 a jejich přirozené ligandy z genové rodiny clec2 představují alternativní "missing-self" NK buněčný systém rozpoznávání, založený na interakci vysoce příbuzných receptorů podobných C-lektinům. Lidské NKR-P1 bylo objeveno před vice než dvaceti lety, přesto stále zůstává jediným lidským orthologem této receptorové rodiny početné především u hlodavců. Po navázání na svůj přirozený ligand LLT1 receptor NKR-P1 může předávat inhibiční nebo kostimulační signály. Pro svou potenciální roli v imunitním úniku nádorů a autoimunitě jsou zajímavými cíli výzkumu, přesto je povaha jejich interakce stále nejasná. Abychom objasnili strukturní povahu jejich interakce, vyvinuli jsme obecně použitelnou metodu pro rekombinantní expresi lidského NKR-P1 a LLT1 a jejich homologů založenou na transfekci buněčné linie HEK293S GnTI- . Popsali jsme stabilizující mutaci His176Cys umožňující přípravu vysoce stabilního rozpustného receptoru LLT1. Připravený receptor LLT1 a lidské NKR-P1 jsme vykrystalizovali v různých glykosylačních stavech jednak samostatně a také v jejich komplexu. Struktury LLT1 i NKR-P1 obsahují klasické...
|
|
|
Cell signalling and molecular complexes of the TRH receptor
Drastichová, Zdeňka
První část disertační práce se zabývá identifikací proteinů isolovaných ve frakci obohacené o plasmatické membrány získané z buněčné linie HEK293-E2M11, jejichž hladina byla změněna po dlouhodobém působení thyroliberinem. Pomocí imunoblotu se specifickými protilátkami proti Na+ ,K+ - ATPase a vazebných pokusů s [3 H]TRH a [35 S]GTPγS bylo zjištěno, že frakce obohacená o plasmatické membrány obsahovala v porovnání s postnukleárním supernatantem výrazně vyšší množství Na+ ,K+ - ATPasy, TRH receptoru and G-proteinů. Pro detekci a identifikaci proteinů ve frakci obohacené o plasmatické membrány, jejichž hladiny byly po dlouhodobém působení TRH (16 h; 10 μM) změněny, byly použity 2D-elektroforéza a hmotnostní spektrometrie. Bylo identifikováno 42 proteinů, z nichž pět proteinů (mitofilin, MTHSP75, prohibitin, stomatin like-2, peroxiredoxin III) představuje mitochondriální proteiny, které jsou důležité pro správnou strukturu a funkci mitochondrií. Hladina těchto proteinů byla zvýšena po dlouhodobém působení TRH, a proto lze usuzovat, že dlouhodobé působení TRH může výrazně ovlivnit mitochondriální membránu a funkci mitochondrií. Druhá část disertační práce se zabývá identifikací molekulárních komplexů TRH receptoru a/nebo Gq/11 proteinu. Pomocí nativní elektroforézy byly identifikovány tři komplexy...
|
|
|
Interaction of a surface marker of immune cells with low-molecular weight ligands and their polymer conjugates
Šimonová, Lenka ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Každý rok zemřou na rakovinu miliony lidí po celém světě. V posledním desetiletí nabízí imunoterapie nové léčebné přístupy s dlouhotrvajícími remisemi u řady pa- cientů. Úřad pro kontrolu potravin a léčiv (Food and Drug Administration, FDA) schválil několik nových léčiv založených na imunoterapii. Nicméně, pro většinu pacientů je tato léčba neúčinná, případně se nemoc brzy znovu projeví. Slibně se dnes jeví hledání a zkoumání nových kontrolních bodů imunitního systému a léčba kombinující cílení různých těchto bodů. Tato práce se zaměřuje na nový cíl imunoterapie - CD73. CD73 je membránová ektonukleotidasa, vysoce exprimovaná v regulačních leukocytech a v rakoviných buňkách. Svojí enzymatickou aktivitou, tvorbou imunosupresivního adenosinu, přispívá k vytváření nádorového mikroprostředí. Tento nový kontrolní bod imu- nitního systému je proto intensivně studován. Cílem této práce je vývoj nových metod cílení a inhibice CD73. Rozpustná forma rekombinantní lidské CD73 (rhCD73) byla připravena v savčím expresním systému, dále byla také připravena buněčná linie stabilně exprimující CD73 na svém povrchu. Inhibitory potřebné pro oba zmíněné cíle byly navrženy na základě struktury publikovaného inhibitoru CD73. Protilátkové mimetikum pro charakterisaci CD73 bylo vyvinuto a evaluováno. Tento HPMA polymerní...
|
|
|
Preparation of strategy for studying interaction of human constitutive androstane receptor with steroid receptor coactivator-1
Šachová, Ivana ; Martin, Jan (vedoucí práce) ; Mladěnka, Přemysl (oponent)
Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakognozie Kandidát: Ivana Šachová Školitelé: PharmDr. Jan Martin, PhD., Dipl. Ing. Mgr. Ferdinand Molnár, PhD. Název diplomové práce: Příprava strategie pro studium interakcí mezi konstitutivním androstanovým receptorem (CAR) a koaktivátorem steroidního receptoru 1 Cílem této práce byla exprese wild type a mutovaných centrálních domén lidského SRC1 v buňkách E. coli BL21 DE3. Exprimované rekombinantní proteiny byly následně čištěny a použity pro studium SRC1-CAR interakcí za využití separace pomocí afinitních ligandů(pull down). Konstitutivní androstanový receptor (CAR), nukleární receptor, je transkripční regulátor, který ovlivňuje expresi nejrůznějších proteinů, jako jsou enzymy biotransformace a transportery významné pro metabolismus jak endogenních tak exogenních látek. CAR může být plně aktivní pouze v přítomnosti koaktivátorů jako je např. koaktivátor steroidního receptoru 1 (SRC1). Nejdůležitější fragment SRC1 pro vazbu na nukleární receptor je centrální doména, tvořená třemi α-helickými Leu-X-X-Leu-Leu (LXXLL) L1, L2, L3 motivy, v nichž L reprezentuje leucin a X znázorňuje jakoukoli aminokyselinu. hSRC1, stejně tak hCAR, mohou být produkovány pomocí exprese příslušných genů v kmenech E. coli. V případě SRC1, kodon...
|
|
|
Study of structure and interaction of human lymphocyte receptors
Bláha, Jan
Přirozené zabíječské (Natural killer, NK) buňky jsou důležitou složkou imunitního systému poskytující dohled nad viry infikovanými, stresem transformovanými nebo rakovinnými buňkami. Receptory NKR-P1 a jejich přirozené ligandy z genové rodiny clec2 představují alternativní "missing-self" NK buněčný systém rozpoznávání, založený na interakci vysoce příbuzných receptorů podobných C-lektinům. Lidské NKR-P1 bylo objeveno před vice než dvaceti lety, přesto stále zůstává jediným lidským orthologem této receptorové rodiny početné především u hlodavců. Po navázání na svůj přirozený ligand LLT1 receptor NKR-P1 může předávat inhibiční nebo kostimulační signály. Pro svou potenciální roli v imunitním úniku nádorů a autoimunitě jsou zajímavými cíli výzkumu, přesto je povaha jejich interakce stále nejasná. Abychom objasnili strukturní povahu jejich interakce, vyvinuli jsme obecně použitelnou metodu pro rekombinantní expresi lidského NKR-P1 a LLT1 a jejich homologů založenou na transfekci buněčné linie HEK293S GnTI- . Popsali jsme stabilizující mutaci His176Cys umožňující přípravu vysoce stabilního rozpustného receptoru LLT1. Připravený receptor LLT1 a lidské NKR-P1 jsme vykrystalizovali v různých glykosylačních stavech jednak samostatně a také v jejich komplexu. Struktury LLT1 i NKR-P1 obsahují klasické...
|
|
|
Transmembránové proteiny ASCT1 a ASCT2 a jejich interakce s retrovirovými obalovými glykoproteiny
Trávníček, Martin ; Trejbalová, Kateřina (vedoucí práce) ; Mělková, Zora (oponent)
Transmembránové proteiny ASCT1 a ASCT2 patří mezi rozšířené buněčné transportéry neutrálních aminokyselin. Nezávisle na své transportní roli v metabolicky aktivních buňkách, slouží také jako receptory mnoha retrovirů. Všechny retroviry, které interagují s receptorem ASCT2, popř. ASCT1, sdílí příbuzný obalový glykoprotein. Mezi tyto glykoproteiny patří mimo jiné Syncytin-1, kódovaný lidským endogenním retrovirem typu W, který je produkován v placentárním cytotrofoblastu primátů včetně člověka. Interakce receptor-vazebné domény Syncytinu-1 se specifickou extracelulární oblastí ASCT2 způsobuje fúze sousedních buněk a vznik mnohojaderného syncytiotrofoblastu. Význam syncytiotrofoblastu spočívá v efektivnějším příjmu živin plodem z krve matky a zároveň v modulaci imunitní odpovědi matky vůči plodu. Tyto vlastnosti jsou nezbytné pro správný vývoj nového jedince, poruchy se vznikem syncytiotrofoblastu často vedou ke komplikacím během těhotenství. Charakterizace proteinových domén, zodpovědných za interakci mezi Syncytinem-1 a jeho receptory, je tak důležitým krokem při odhalování genetických příčin těchto patologií. Zároveň nám tyto poznatky pomáhají objasnit mechanismus buněčného vstupu i u dalších retrovirů a vysvětlují nám molekulární podstatu senzitivity nebo rezistence hostitele k těmto retrovirům. ASCT1,...
|
|
|
Interaction of a surface marker of immune cells with low-molecular weight ligands and their polymer conjugates
Šimonová, Lenka ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Každý rok zemřou na rakovinu miliony lidí po celém světě. V posledním desetiletí nabízí imunoterapie nové léčebné přístupy s dlouhotrvajícími remisemi u řady pa- cientů. Úřad pro kontrolu potravin a léčiv (Food and Drug Administration, FDA) schválil několik nových léčiv založených na imunoterapii. Nicméně, pro většinu pacientů je tato léčba neúčinná, případně se nemoc brzy znovu projeví. Slibně se dnes jeví hledání a zkoumání nových kontrolních bodů imunitního systému a léčba kombinující cílení různých těchto bodů. Tato práce se zaměřuje na nový cíl imunoterapie - CD73. CD73 je membránová ektonukleotidasa, vysoce exprimovaná v regulačních leukocytech a v rakoviných buňkách. Svojí enzymatickou aktivitou, tvorbou imunosupresivního adenosinu, přispívá k vytváření nádorového mikroprostředí. Tento nový kontrolní bod imu- nitního systému je proto intensivně studován. Cílem této práce je vývoj nových metod cílení a inhibice CD73. Rozpustná forma rekombinantní lidské CD73 (rhCD73) byla připravena v savčím expresním systému, dále byla také připravena buněčná linie stabilně exprimující CD73 na svém povrchu. Inhibitory potřebné pro oba zmíněné cíle byly navrženy na základě struktury publikovaného inhibitoru CD73. Protilátkové mimetikum pro charakterisaci CD73 bylo vyvinuto a evaluováno. Tento HPMA polymerní...
|
host ::
RSS.