|
|
Izolace DNA v kvalitě pro PCR z mléčných výrobků pro dětskou výživu
Mantlová, Jana ; Eva, Kvasničková (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
Práce byla zaměřena na izolaci DNA v kvalitě pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR) a identifikaci probiotických bakterií mléčného kvašení, které byly izolovány z pěti mléčných výrobků pro dětskou výživu. DNA byla z hrubých lyzátů buněk výrobku izolována pomocí magnetických mikročástic P(HEMA-co-GMA). Metodou fenolové extrakce byla izolována DNA z hrubých lyzátů buněk kontrolních kmenů, která byla využita jako pozitivní kontrola. Pomocí metod PCR byly ve výrobcích identifikovány DNA rodu Bifidobacterium a druhů B. animalis, B. bifidum, B. breve, B. infantis, B. longum a druhu Streptococcus thermophilus. Dosažené výsledky jsou v souladu s údaji deklarovanými výrobcem.
|
|
|
Identifikace vybraných druhů bakterií mléčného kvašení v mléčných výrobcích
Vystavělová, Růžena ; Trachtová, Štěpánka (oponent) ; Rittich, Bohuslav (vedoucí práce)
Bakterie mléčného kvašení jsou přirozenou součástí gastrointestinálního traktu člověka. Pro své probiotické účinky jsou často používány do doplňků stravy a pro výrobu fermentovaných mléčných výrobků. Diplomová práce byla zaměřena na identifikaci vybraných druhů bakterií mléčného kvašení a bifidobakterií v sýrech a mléčných výrobcích. Bakteriální DNA byla izolována pomocí magnetických částic P(HEMA-co-GMA) z hrubých lyzátů buněk 9 výrobků. Izolovaná DNA byla amplifikována pomocí rodově a druhově specifické polymerázové řetězové reakce (PCR). Získané amplikony byly detegovány agarózovou gelovou elektroforézou. Výsledky PCR byly porovnány s údaji uvedenými výrobcem a byla konstatována shoda.
|
|
| |
|
|
Využití magnetických částic pro izolaci a purifikaci DNA
Němeček, Milan ; Španová, Alena (oponent) ; Rittich, Bohuslav (vedoucí práce)
S rozvojem molekulárně biologických metod se zvyšuje zájem o nové postupy izolace DNA o vysoké kvalitě. Izolace DNA se provádí z hrubých lyzátů buněk mnoha technikami např. fenolovou extrakcí, vysolováním nebo adsorpcí na pevnou fázi. Klasická izolace DNA, jakou je fenolová extrakce je poměrně složitá a časově náročná. Z toho důvodu byly vyvinuty nové alternativní metody izolace DNA využívající reverzní imobilizaci DNA na pevnou fázi. Velmi rozšířené je používání magnetických nosičů, které umožňují izolovat DNA ve vysoké kvalitě přímo z hrubých lyzátů buněk komplexních vzorků. Současná metoda adsorpce DNA na povrch magnetických částic neposkytuje v některých případech při analýze komplexních vzorků (např. potravin) dostatečně čistou DNA. Část inhibitorů polymerázové řetězové reakce (PCR) se zřejmě adsorbuje na stěny zkumavky, při eluci DNA dochází k jejich uvolnění do roztoku a následnému ovlivnění kvality DNA (např. snížení citlivosti amplifikace v PCR). Principem vyvíjeného postupu je konstrukce zařízení, které využívá přenos magnetických částic paramagnetickou jehlou z jedné Eppendorfovy zkumavky do druhé, ve které probíhá další zpracování vzorku. Přenosem pomocí jehly se zabraňuje přenosu kontaminujících nečistot. Navržené zařízení umožňuje realizovat výše uvedený postup. Funkčnost zařízení byla ověřena při izolaci plasmidové pUC19 DNA z hrubých lyzátů buněk E. Coli JM 109 (pUC19).
|
|
|
Využití magnetických částic pro izolaci DNA z vybraných druhů koření
Gaňová, Martina ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Kovařík, Aleš (vedoucí práce)
Izolácia DNA z rastlinného pletiva v požadovanej kvalite je veľmi komplikovaná, hlavne z dôvodu prítomnosti látok, ktoré môžu interferovať pri amplifikácii DNA. Týmito látkami sú hlavne polyfenoly, polysacharidy, proteíny a rôzne farbivá. Chemická rôznorodosť takýchto látok môže mať významný vplyv na výťažok a kvalitu DNA pri použití jedného izolačného postupu. Hlavným cieľom práce bolo vyhodnotiť použitie mikroizolačného protokolu u príbuzných matríc na kvalitu izolovanej DNA ako aj zhodnotenie vplyvu inhibítorov izolovaných spolu s nukleovou kyselinou na jej amplifikáciu v PCR. DNA bola izolovaná zo sušenej mletej papriky (Capsicum annuum). V prvej fáze boli vzorky homogenizované s použitím lyzačného roztoku s cetyl trimetyl amónium bromidom. Následne bola DNA purifikovaná pomocou reverzibilnej adsorbcie na magnetické nosiče. Celkom bolo testovaných šesť rôzne modifikovaných nosičov. Koncentrácia a čistota získanej DNA bola stanovená spektrofotometricky meraním absorbancie roztoku DNA v TE pufre. Kvalita DNA bola overená amplifikáciou v PCR. Boli použité priméry špecifické pre rastlinnú ribozomálnu DNA (rDNA). Prítomnosť produktov PCR bola dokázaná agarózovou gélovou elektroforézou. Bolo zistené, že použitou mikrometódou je možné izolovať DNA odpovedajúcej čistoty, ktorá je vhodná pre genetickú analýzu pomocou PCR. Boli zistené rozdiely medzi magnetickými nosičmi, ktoré boli testované pre izoláciu DNA.
|
|
|
Použití vysokorozlišovací analýzy křivek tání ke studiu baktérií mléčného kvašení
Knápková, Monika ; Němcová, Andrea (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
V současné době roste zájem o užívání probiotických výrobků a na trhu je jich celá řada. S rostoucím zájmem je kladen i větší důraz na identifikaci deklarovaných probiotických mikroorganismů. Přesná identifikace mikrobiálního složení je často nelehkým úkolem a je zapotřebí pokročilejších metod, zejména z oblasti molekulární diagnostiky. Diplomová práce byla zaměřena na ověření přítomnosti deklarovaných probiotických mikroorganismů v probiotických doplňcích stravy GS Laktobacily Forte 21, Biopron 9 Premium a Linex® Forte. DNA byla z komplexních matric izolována fenolovou extrakcí, komerčním kitem a magnetickými nosiči F79/L3-PLL v kvalitě vhodné pro PCR. Následně byla izolovaná DNA amplifikována polymerázovou řetězovou reakcí v reálném čase s využitím rodově a druhově specifických primerů. Specifický PCR produkt byl podroben agarózové gelové elektroforéze, přičemž druhová identifikace nebyla vždy v souladu s údaji deklarovanými výrobci. Další část práce se zabývala polymerázovou řetězovou reakcí s vysokorozlišovací analýzou křivek tání za účelem rozlišení bakteriálních kmenů patřících do skupiny Lactobacillus a za účelem identifikace probiotických mikroorganismů přítomných ve směsi v probiotických doplňcích stravy. Bylo testováno osm sad primerů (V1F HRM a V1R-HRM, CHAU-V3F a CHAU-V3R, CHAU-V6F a CHAU-V6R, LAC2 a LAC4, LAC1 a LAC2, P1V1 a P2V1, poxcDNAFw a poxPromRVC, poxcDNAFw a poxPromRVT). Jako nejvhodnější pro rozlišení bakteriálních kmenů rodu Lactobacillus byly vyhodnoceny tři dvojice primerů (V1F HRM a V1R-HRM, poxcDNAFw a poxPromRVC, poxcDNAFw a poxPromRVT).
|
|
|
Využití různých metod izolace DNA baktérií mléčného kvašení v molekulárně biologických metodách
Chvalkovská, Eva ; Skoumalová, Petra (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Předkládaná práce se zabývá probiotickými bakteriemi, izolací DNA z těchto baterií třemi různými metodami a vlivu izolace na identifikaci DNA pomocí molekulárně biologických metod. Probiotické bakterie jsou důležitou součástí trávícího traktu člověka. Mají důležitou roli pro funkci imunitního systému, a to díky adhezi na sliznici trávícího traktu, kde vytváří nehostinné prostředí pro patogeny. Probiotické baterie přijímáme běžně v potravě, ať už v mléčných výrobních nebo pomocí doplňků stravy. Díky nadužívání antibiotik ovšem hrozí riziko předání vnitřní rezistence, kterou probiotické bakterie mají kvůli udržení přirozené homeostáze trávícího traktu, patogenním bakteriím. Je tedy důležité efektivně identifikovat rizikové probiotické bakterie, které mají schopnost rezistenci přenášet a eliminovat tak jejich přítomnost v potravinách a potravinových doplňcích. V experimentální části byly zkoumány tři metody izolace DNA, metoda fenolové extrakce, izolace magnetickými částicemi a izolace komerčním kitem. DNA byla izolovaná ze tří doplňků stravy a to Biopron 9 premium, Linex forte a GS Laktobacily forte 21. Čistota a koncentrace izolované DNA byla zjištěna spektrofotometricky. Přítomnost jednotlivých kmenů DNA v potravinových doplňcích byla potvrzena metodou polymerázové řetězové reakce v reálném čase. Jako nejlepší metoda izolace, co se týče čistoty a koncentrace izolované DNA byla na základě RT–PCR a spektrofotometrie vyhodnocena metoda izolace komerčním kitem.
|
|
|
Využití magnetických částic při izolaci DNA z výrobků z obilovin
Starenkova, Anastasiia ; Španová, Alena (oponent) ; Rittich, Bohuslav (vedoucí práce)
Diplomová práce byla zaměřena na testování mikroizolace DNA za pomocí magnetických částic z ereálních výrobků v kvalitě vhodné pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR). Pro analýzu byly vybrány cereální sušenky a výrobky pro děti. Vzorky byly homogenizovány s použitím plastového kopistu v lyzačním roztoku s cetyltrimetylammonium bromidem (CTAB). Homogenáty byly purifikovány směsí chloroform-oktanol. Při přípravě homogenátu byl také testován vliv isopropanolu. Homogenáty byly použity pro izolaci DNA magnetickými částicemi. Byly testovány dva spůsoby separace magnetických částic s navázanou DNA (magnetický separátor a magnetická jehla). Izolovaná DNA byla analyzována spektrofotometricky - byla zjišťována její koncentrace a čistota. Poté byla ověřována amplifikovatelnost DNA v PCR. Pro amplifikaci byly použity dvě sady primerů specifických pro rostlinnou ribosomální DNA. Produkty PCR s očekávanou délkou 700 a 220 bp byly detegovány agarózovou gelovou elektroforézou. Bylo zjištěno, že DNA izolovaná ze zrn cereálií, nakličených zrn a cereálních výrobků pomocí testovaných magnetických nosičů byla v kvalitě vhodné pro PCR.
|
|
|
Imunochemická detekce proteinu TNF-α pomocí magnetických částic
Koudelková, Žaneta
Diplomová práce se zabývá optimalizací a vývojem metody pro imunochemickou detekci cytokinu TNF-α založené na principu sendvičové ELISA s využitím magnetických částic. Pro analýzu byly využity magnetické částice funkcionalizované pomocí karboxylových skupin, které umožňují vazbu protilátek. Optimalizací podmínek aktivace částic bylo stanoveno optimální pH MES pufru, koncentrace EDC a způsob aktivace. V druhé části práce byly optimalizovány podmínky průběhu sendvičové ELISA na magnetických částicích. Optimální inkubační doba s antigenem byla stanovena na 3 hodiny a inkubační doba s detekční protilátkou na 1,5 hodiny. Optimalizované podmínky aktivace částic a ELISA byly využity při tvorbě kalibrační křivky standardu TNF-α. Optimalizovaný protokol ELISA na magnetických částicích může být využit ke snadné a efektivní analýze komplexních vzorků jako je krevní sérum, moč nebo sliny.
|
|
|
Detekce solubilního endoglinu v Lab-in-Syrige
Ilićová, Marie ; Svobodová, Zuzana (vedoucí práce) ; Chocholouš, Petr (oponent)
Hlavním úkolem diplomové práce bylo vyvinout automatizované metody pro izolaci endoglinu ze vzorku pomocí magnetického imunosorbentu v Lab-In-Syringe s následnou imunodetekcí na affiblotu. Teoretická část se věnuje endoglinu v jeho membránové i solubilní formě, zejména jejich souvislostem s endotelovou dysfunkcí. Je zde také stručně popsán princip anti-endoglinové terapie pomocí monoklonální protilátky carotuximab neboli TRC105. Dále jsou v teoretické části shrnuty informace o technikách Lab-In-Syringe a affiblot. Poslední kapitola pojednává o biofunkcionalizaci magnetických částic pomocí protilátek za účelem přípravy magnetického imunosorbentu a jeho využití pro izolaci proteinu ze vzorku. V experimentální části jsou nejprve popsány postupy pro otestování prototypů affiblotu. Hlavním cílem bylo vyvinout metodu pro přípravu anti-endoglinového magnetického imunosorbentu a zvýšit kapacitu metody jejím převedením z 1ml do 5ml stříkačky (upscaling). Dále byly vyvinuty metody pro izolaci solubilní formy lidského endoglinu z kultivačního média s obsahem léčiva TRC105, které interferuje s jeho imunodetekcí, opět pro 1ml a 5ml stříkačku. Byla provedena řada experimentů za účelem optimalizace metod v Lab-In-Syringe a na závěr byly metody vyzkoušeny se vzorky a výsledky se hodnotily na affiblotu. Klíčová...
|
host ::
RSS.