|
|
Analysis of substrate specificity and mechanism of GlpG, an intramembrane protease of the rhomboid family.
Peclinovská, Lucie ; Stříšovský, Kvido (vedoucí práce) ; Konvalinka, Jan (oponent)
Proteiny z rodiny rhomboidů jsou široce konservované v evoluci a obsahují dvě velké podskupiny, proteolyticky aktivní intramembránové proteasy serinového typu (rhomboidy) a rhomboidům podobné proteiny, které během evoluce ztratily proteolytickou aktivitu, ale zachovaly si schopnost vázat membránový helix jiných proteinů. Zástupci obou těchto skupin hrají významnou roli v celé řadě biologických procesů, jako například v buněčné signalizaci, v mechanismech podílejících se na kontrole kvality sbalení proteinů v endoplasmatickém retikulu, v mitochondriální dynamice a také v hojení ran. Ačkoliv medicinský potenciál proteinů z rodiny rhomobidů vzrůstá, pochopení strukturní podstaty jejich funkce pokulhává. Hlavním strukturním a mechanistickým modelem pro pro rodinu rhomboidů a vlastně pro intramembránové proteasy obecně se stal rhomboid GlpG z E.coli, který byl první intramembránovou proteasou jejíž rentgenová struktura byla vyřešena. Substráty GlpG jsou membránové proteiny s jedním transmembránovým helixem a ke štěpení dochází v jejich transmembránové části, ale mechanismus vazby substrátu na enzym ani podstata substrátové specifity nejsou plně pochopeny. Tato práce se zabývá charakterizací významu transmembránové domény substrátu pro jeho rozpoznání proteasou GlpG a využívá hlavně enzymové kinetiky a...
|
|
|
Srovnání citlivosti bezkontaktní vodivostní detekce a přímé UV detekce při elektroforetickém stanovení N-acetylaminosacharidů
Malý, Michal ; Křížek, Tomáš (vedoucí práce) ; Kozlík, Petr (oponent)
Tato práce se zabývá vývojem a optimalizací metody separace N-acetylglukosaminu a jeho dimeru a tri- meru kapilární zónovou elektroforézou s využitím bezkontaktní vodivostní detekce. Bylo zjištěno, že sepa- race a detekce těchto látek je možná, pokud je jako pracovní elektrolyt použit hydroxid sodný, použití jiných elektrolytů jako hydrogenfosforečnanu sodného mělo za následek nepřijatelně vysoký šum základní linie. Optimální podmínky pro provedení separace byly při koncentraci pracovního elektrolytu 40 mmol dm−3 a pracovním napětí 15 kV. Metoda je velmi citlivá na pH pracovního elektrolytu a použitý pracovní elektrolyt způsobuje rychlou degradaci kapiláry. Z těchto důvodů je obtížné spolehlivě provést kalibraci. Vyvinutá metoda byla porovnána s již existující metodou pro separaci těchto analytů využívající UV detekci. Exis- tující metoda má v porovnání s vyvinutou metodou nižší meze detekce a stanovitelnosti a je méně citlivá na pracovní podmínky. Meze detekce a stanovitelnosti vyvinuté metody jsou 34 µmol dm−3 , respektive 104 µmol dm−3 , meze detekce a stanovitelnosti metody využívající UV detekci jsou 7 µmol dm−3 , respek- tive 21 µmol dm−3 . Uvedené meze stanovitelnosti jsou uvedeny pro analyt, pro který byla detekce nejméně citlivá, v obou případech šlo o dimer. Výhodou vyvinuté metody proti...
|
|
|
Protease Inhibitors as a Research Tool: Design, Synthesis and Evaluation of HIV PR and GCPII Inhibitors
Schimer, Jiří ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Ruml, Tomáš (oponent)
Hlavním cílem teto práce je příprava inhibitorů jako nástroje pro studium a potenciální zásah do procesů regulovaných proteasami. V této práci jsem se zaměřil na dvě významné proteasy: HIV protreasu (HIV PR), která hraje nepostradatelnou roli během dozrávaní virových částic, a glutamátkarboxypeptidasu II (GCPII), důležitý marker rakoviny nádorů prostaty. Racionální návrh inhibitorů medicínsky významných enzymů slouží hned dvěma účelům: za prvé, jak se ukázalo, jsou inhibitory účinnými virostatiky (HIV proteasa je pravděpodobně vůbec nejlepším příkladem úspěšného vývoje léčiv pomocí racionálního návrhu) a za druhé, - v kontextu této disertační práce pravděpodobně i důležitěji - inhibitory mohou sloužit též jako nástroje pro rozšifrování základních biologických otázek týkajících se regulace, načasování a časoprostorové kontroly takových zásadních procesů, jako je maturace virových částic či vznik rakovinových buněk. Proteasa viru lidské imunitní nedostatečnosti Virus lidské imunitní nedostatečnosti (HIV) způsobující AIDS zabil v průběhu posledních čtyř desetiletí vice než 40 milionů lidí, z čehož 1,5 milionu zemřelo jen v minulém roce. Nakažených pacientů je v současné chvíli více než 35 milionů a toto číslo se stále zvyšuje, zejména v méně rozvinutých zemích sub-saharské Afriky. Především kvůli...
|
|
| |
|
|
Inhibitors of mouse serine racemase
Vorlová, Barbora ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Vaněk, Ondřej (oponent)
Serinracemasa je pyridoxal-5'-fosfát dependentní enzym zodpovědný za biosyntézu D-serinu v centrální nervové soustavě. D-serin je důležitý neurotrasmiter, který se podílí na aktivaci N- methyl-D-aspartátových receptorů pro glutamát. Nadměrná stimulace zmíněných receptorů může vést k různým neuropatologiím, jako je Alzheimerova choroba, amyotropní laterální skleróza, epilepsie a další. Pro zmírnění příznaků těchto onemocnění se v klinické praxi využívají přímé blokátory NMDA receptorů. Řada těchto látek ale způsobuje nežádoucí účinky a je tedy zapotřebí hledat méně škodlivé blokátory či regulátory působící na jiné cíle terapeutického zásahu, které přímo ovlivňují aktivaci NMDA receptorů. V této souvislosti se právě specifická inhibice serinracemasy zdá být slibnou strategií pro snížení nadměrné stimulace dotyčných receptorů. Myší serinracemasa sdílí 89% identitu se svým lidským ortologem, přičemž bylo prokázáno, že oba zmíněné enzymy vykazují podobné kinetické parametry a jsou inhibovány stejnými látkami s podobnou efektivitou. Pro hledání potentních inhibitorů lidské serinracemasy tedy mohou být využity myší modely. Nicméně, i přesto, že byla testována celá řada nejrůznějších látek, vysoce efektivní inhibitory serinracemasy ještě nebyly identifikovány. Tato studie měla za cíl navázat na výzkum...
|
|
|
Studium mechanismu účinku metallakarboranových inhibitorů HIV proteasy
Svoboda, Michal ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Krátce po identifikaci viru HIV jako původce onemocnění AIDS byla v genetické informaci viru objevena sekvence naznačující přítomnost aspartátové proteasy. Proteasa, která byla později u viru skutečně potvrzena, se posléze stala jedním z hlavních terapeutických cílů při boji proti onemocnění AIDS. Zavedení proteasových inhibitorů do antiretrovirové terapie vedlo k výraznému zkvalitnění a prodloužení života virem infikovaných pacientů. Virus, díky své genetické variabilitě, je však schopen se působení inhibitorů poměrně efektivně bránit tvorbou mutantních variant, jež jsou vůči inhibitorům resistentní. Existuje proto stálá potřeba nových inhibitorů, schopných efektivně blokovat i tyto resistentní varianty, a současně zpomalujících vznik nových resistentních variant. Cestou k takovým inhibitorům by mohlo být hledání sloučenin interagujících s enzymem jinde než v jeho aktivním místě, mechanismy nekompetitivní nebo akompetitivní inhibice. Skupinou látek, u nichž byla identifikována schopnost inhibovat HIV proteasu těmito netradičními mechanismy jsou metallakarborany, anorganické sloučeniny bóru, uhlíku, vodíku a iontu přechodného kovu. Pro další optimalizaci těchto inhibitorů je třeba strukturně a biofyzikálně charakterizovat jejich interakci s enzymem. Předkládaná práce je zaměřena na vývoj nástrojů...
|
|
|
Mechanism of action of non-peptide inhibitors of HIV protease
Began, Jakub ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Bořek Dohalská, Lucie (oponent)
Inhibice HIV-1 proteasy hraje významnou roli v boji proti viru HIV. Od roku 1995 bylo na trh uvedeno devět inhibitorů HIV-1 proteasy, avšak jejich účinnost klesá vinou vzniku rezistence viru vůči inhibitorům. Proto je potřeba vyvíjet účinnější léčiva s novými strukturními motivy a mechanismy účinku. V nedávné době byla u několika inhibitorů pozorována jejich vazba i mimo aktivní místo proteasy. Darunavir, jenž je posledním schváleným inhibitorem HIV-1 proteasy a vykazuje kompetitivní typ inhibice, se pravděpodobně také váže do oblasti chlopní HIV-1 proteasy. Dvě studie podporující tento alternativní způsob vazby byly založeny na kinetických měřeních a rentgenové krystalografii. Je však otázkou, zda-li dochází k této vazbě i za fyziologických podmínek anebo zda-li se jedná pouze o krystalizační artefakt. I další data podporují alternativní vazbu darunaviru s vysoce mutovanou HIV-1 proteasou: pomocí termodynamické analýzy bylo prokázano, že na dimerní HIV-1 proteasu se váží dvě molekuly darunaviru. Nicméně toto pozorování nebylo potvrzeno rentgenovou krystalografií, neboť darunavir byl v krystalové struktuře přítomen pouze v aktivním místě HIV-1 proteasy. Tato vysoce mutovaná varianta HIV-1 proteasy se proto stala předmětem dalšího zkoumání. Pro studium mechanismu vazby darunaviru na mutovanou...
|
|
|
Separace a stanovení možných produktů enzymového štěpení 4-nitrofenyl-N,N'-diacetyl-β-D-chitobiosidu pomocí kapilární elektroforézy
Velvarská, Romana ; Křížek, Tomáš (vedoucí práce) ; Kalíková, Květa (oponent)
Tato práce se zabývá vývojem a optimalizací podmínek metody, kterou lze využít k porovnání aktivity enzymu β-N-acetylhexosaminidasy při hydrolýze jejího přirozeného substrátu a tvz. chromogenního substrátu, který se často využívá při studiu enzymové kinetiky. Jako substrát pro štěpení byl zvolen 4-nitrofenyl-N,N'-diacetyl-β- D-chitobiosid. Tento oligosacharid obsahuje vazbu, kterou enzym štěpí v přirozeném substrátu, a zároveň také vazbu, která se vyskytuje v substrátu chromogenním. Pro stanovení produktů, jež vznikají při enzymatické hydrolýze 4-nitrofenyl-N,N'-diacetyl- β-D-chitobiosidu byla využita kapilární zónová elektroforéza. Nejprve bylo nutno najít optimální složení základního elektrolytu, tedy jeho hodnotu pH a koncentraci. Optimálním základním elektrolytem byl roztok tetraboritanu sodného o koncentraci 25 mmol/l a hodnotě pH 10,25. Následně byla zjištěna opakovatelnost měření, kalibrační závislosti a linearita, limit detekce a limit kvantifikace. Opakovatelnost migračních časů se pohybovala do 0,6%, opakovatelnost plochy píků pak v rozmezí 2,5 až 6,3%. Limity detekce metody byly v rozmezí 0,005-0,120 mmol/l. Nakonec byla optimalizovaná metoda úspěšně použita ke sledování průběhu skutečného enzymového štěpení.
|
|
|
Characterization of N-demethyllincomycin-methyltransferase.
Poľan, Marek ; Najmanová, Lucie (vedoucí práce) ; Petříčková, Kateřina (oponent)
Linkomycín je prírodne antibiotikum zaradené do skupiny linkozamidových antibiotík, ktorého zhluk biosyntetických génov je známy a funkcia mnohých génov z tohto zhluku už bola popísaná. Táto práca je zameraná na štúdium záverečného kroku bisyntetickej dráhy linkomycínu, metyláciu na dusíku pyrolového reťazca propylprolínovej podjednotky N-demetyllinkomycínu (NDL). Cieľom práce bolo charakterizovať enzým LmbJ, katalyzujúci tento biosyntetický krok. Všetky stanovenia boli uskutočnené pre enzým LmbJ s histidínovou kotvou, ktorý bol pripravený heterológnou expresiou v bunkách Escherichia coli. Bolo stanovené teplotné a pH optimum metylačnej reakcie, rovnako ako Michelisove konštanty pre oba substráty reakcie: N-demetyllinkomycín a S-adenozylmetionín (SAM - donor metylovej skupiny). S výnimkou pH optima se všetky stanovené parametre výrazne odlišovali od publikovaných údajov pre enzým izolovaný z prirodzeného zdroja. Na základe porovnania výsledkov elektrónovej mikroskopie, natívnej elektroforézy a gélovej filtrácie bol vytvorený predpokladaný model kvartérnej štruktúry enzýmu. Na rozdiel od väčšiny doteraz popísaných metyltransferáz, ktoré sa vyskytujú v monomérnej, dimérnej alebo tetramérnej forme, sa v našom prípade jedná s najväčšou pravdepodobnosťou o hexamér.
|
|
|
Kinetic behavior of the NAD(P)H:Quinone oxidoreductase WrbA from Escherichia coli.
KISHKO, Iryna
Předkládaná dizertační práce se zabývá strukturně-funkčním vztahem multimerické oxidoreduktázy WrbA. Především vysvětluje neobvyklou kinetiku tohoto enzymu na molekulární úrovni, čímž poskytuje vzhled do fyziologické role tohoto enzymu v bakteriích. Multimerický enzym WrbA, jehož kofaktorem je FMN, katalyzuje oxidaci NADH přenosem dvou elektronů. Dle strukturálních a funkčních kritérii patří Wrba mezi bakteriální flavodoxiny, z evolučního hlediska se jedná o eukaryotickou oxidoreduktázu. Kinetické chování enzymu WrbA bylo studováno při různých podmínkách (teplota, pH atd.). Mechamismus kinetiky byl určen z parametrů KM a Vmax a potvrzen analizou inhibici produktami reakce. Krystalizace a proteolytické pokusy potvrzují funkční důležitost multimerizace enzymu WrbA a pomáhají pochopit fyziologickou roli tohoto enzymu na molekulární úrovni.
|
host ::
RSS.