|
|
Bioaktivní molekuly zapojené do zpracování krve u hematofágních monogeneí čeledi Diplozoidae
Jedličková, Lucie
Monogenea z čeledi Diplozoidae (podtřída Heteronchoinea) jsou krevsající ektoparaziti nacházející se na žábrách kaprovitých ryb. Trávení krve u diplozoidů probíhá intracelulárně v lysozomálním cyklu buněk gastrodermis střeva za přítomnosti peptidáz parazita. Avšak informace o způsobu trávení krve u této skupiny pocházely dosud pouze z ultrastrukturálních a histochemických analýz. Proto jsem se v této práci zaměřila na biochemickou a molekulární charakteristiku vybraných bioaktivních molekul, které by se mohly podílet na zpracování krve dospělci Eudiplozoon nipponicum, a to konkrétně na cysteinové peptidázy typu katepsinů L a B, aspartické peptidázy typu katepsinu D a na inhibitory serinových peptidáz Kunitzova typu. V homogenátech a exkrečně/sekrečních (E/S) produktech dospělců E. nipponicum dominovala aktivita cysteinových peptidáz typu katepsinu L, následovaná aktivitou aspartických peptidáz typu katepsinu D a minoritním podílem aktivity katepsinů B. Hemoglobinolytická aktivita těchto vzorků byla kompletně zablokována inhibitory jmenovaných typů peptidáz. V transkriptomu dospělců E. nipponicum byly objeveny transkripty kódující 10 katepsinů L a pouze 1 katepsin B. Primární struktury kódovaných enzymů byly bioinformaticky a fylogeneticky porovnány. Dva abundantní katepsiny L (EnCL1, EnCL3) byly...
|
|
|
BIOPHYSICAL AND FUNCTIONAL CHARACTERIZATION OF DDI1-LIKE ASPARTIC PROTEASES INVOLVED IN REPLICATION STRESS RESPONSE
Svoboda, Michal ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Čermák, Lukáš (oponent)
Bezchybná a včasná replikace molekul DNA je jedním z rozhodujících momentů životního cyklu každého organismu. Jakýkoliv defekt, ať už v časování či lokalizaci, může tento delikátní, na přesnosti závislý mechanismus uvrhnout do stavu takzvaného replikačního stresu. Některé z překážek blokujících postup replikační vidličky obsahují proteinovou složku. V průběhu evoluce se tak vyvinuly specializované proteasy, zodpovědné právě za uvolňování replikačního stresu. Kompletní paleta těchto proteolytických enzymů, stejně jako jejich substrátový repertoár a detailní molekulární mechanismus jejich zapojení v obraně proti DNA replikačnímu stresu však dosud nebyly objasněny. Tato disertační práce se zabývá rolí evolučně konzervovaných aspartátových proteas z rodiny proteinů podobných Ddi1 v proteolytické odpovědi na DNA replikační stres. V této práci byly strukturně a biofyzikálně charakterisováni členové rodiny Ddi1 podobných proteinů kvasinkového a lidského původu, byly prozkoumány jejich interakce s ubikvitinem, stejně jako s polyubikvitinovými řetězci. V neposlední řadě byla též mutantního kvasinkového kmene, který vedle genu pro DDI1 postrádá také gen pro DNA aktivovanou metalloproteasu WSS1, identifikována přecitlivělost na hydroxymočovinu, známý inhibitor replikace DNA. Detailní rozbor role kvasinkové...
|
|
|
Bioaktivní molekuly zapojené do zpracování krve u hematofágních monogeneí čeledi Diplozoidae
Jedličková, Lucie
Monogenea z čeledi Diplozoidae (podtřída Heteronchoinea) jsou krevsající ektoparaziti nacházející se na žábrách kaprovitých ryb. Trávení krve u diplozoidů probíhá intracelulárně v lysozomálním cyklu buněk gastrodermis střeva za přítomnosti peptidáz parazita. Avšak informace o způsobu trávení krve u této skupiny pocházely dosud pouze z ultrastrukturálních a histochemických analýz. Proto jsem se v této práci zaměřila na biochemickou a molekulární charakteristiku vybraných bioaktivních molekul, které by se mohly podílet na zpracování krve dospělci Eudiplozoon nipponicum, a to konkrétně na cysteinové peptidázy typu katepsinů L a B, aspartické peptidázy typu katepsinu D a na inhibitory serinových peptidáz Kunitzova typu. V homogenátech a exkrečně/sekrečních (E/S) produktech dospělců E. nipponicum dominovala aktivita cysteinových peptidáz typu katepsinu L, následovaná aktivitou aspartických peptidáz typu katepsinu D a minoritním podílem aktivity katepsinů B. Hemoglobinolytická aktivita těchto vzorků byla kompletně zablokována inhibitory jmenovaných typů peptidáz. V transkriptomu dospělců E. nipponicum byly objeveny transkripty kódující 10 katepsinů L a pouze 1 katepsin B. Primární struktury kódovaných enzymů byly bioinformaticky a fylogeneticky porovnány. Dva abundantní katepsiny L (EnCL1, EnCL3) byly...
|
|
|
Bioaktivní molekuly zapojené do zpracování krve u hematofágních monogeneí čeledi Diplozoidae
Jedličková, Lucie ; Mikeš, Libor (vedoucí práce) ; Horn, Martin (oponent) ; Sojka, Daniel (oponent)
Monogenea z čeledi Diplozoidae (podtřída Heteronchoinea) jsou krevsající ektoparaziti nacházející se na žábrách kaprovitých ryb. Trávení krve u diplozoidů probíhá intracelulárně v lysozomálním cyklu buněk gastrodermis střeva za přítomnosti peptidáz parazita. Avšak informace o způsobu trávení krve u této skupiny pocházely dosud pouze z ultrastrukturálních a histochemických analýz. Proto jsem se v této práci zaměřila na biochemickou a molekulární charakteristiku vybraných bioaktivních molekul, které by se mohly podílet na zpracování krve dospělci Eudiplozoon nipponicum, a to konkrétně na cysteinové peptidázy typu katepsinů L a B, aspartické peptidázy typu katepsinu D a na inhibitory serinových peptidáz Kunitzova typu. V homogenátech a exkrečně/sekrečních (E/S) produktech dospělců E. nipponicum dominovala aktivita cysteinových peptidáz typu katepsinu L, následovaná aktivitou aspartických peptidáz typu katepsinu D a minoritním podílem aktivity katepsinů B. Hemoglobinolytická aktivita těchto vzorků byla kompletně zablokována inhibitory jmenovaných typů peptidáz. V transkriptomu dospělců E. nipponicum byly objeveny transkripty kódující 10 katepsinů L a pouze 1 katepsin B. Primární struktury kódovaných enzymů byly bioinformaticky a fylogeneticky porovnány. Dva abundantní katepsiny L (EnCL1, EnCL3) byly...
|
|
|
Study of the substrate specificity of the LACTB tumour suppressor enzyme
Baudyšová, Alžběta ; Kečkéšová, Zuzana (vedoucí práce) ; Janečková, Lucie (oponent)
Mitochondriální beta-laktamasa (LACTB) je nádorový supresor, jehož exprese způsobuje změny v metabolismu mitochondriálních fosfolipidů a indukuje diferenciaci nádorových buněk v buňky nerakovinné. Tento jev je způsoben down regulací fosfatidylserin dekaboxylasy (PISD), což následně vede ke snížení množství fosfatidyletanolaminů a lysofosfatidyletanolaminů v membráně mitochondrie. PISD ale není LACTB přímo štěpeno a tedy otázka, co je fyziologickým substrátem LACTB, zůstává stále nezodpovězená. Abychom se pokusili zaplnit tuto mezeru v našem poznání o mechanismech a funkci nádorového supresoru LACTB, byla tato diplomová práce zaměřena na nalezení substrátu LACTB pomocí proteomické analýzy PICS. Aby mohla být analýza provedena, bylo třeba nejprve vyizolovat rekombinantní wild-type LACTB a také LACTB se zrušeným katalytickým místem, zjistit, jaké je ideální in vitro prostředí pro práci s rekombinantním LACTB a také jaké podmínky jsou nutné pro to, aby LACTB tvořila multimery. Mé výsledky ukázaly, že aktivita LACTB in vitro stoupá se zvyšujícím se pH a také po přidání vápníku. Také jsem ukázala, že monomery LACTB v multimerních formách jsou spojeny disulfidickými můstky a že se tyto multimery rozpadají po přidání dithiothreitolu. Nejzajímavějším výsledkem práce byl poznatek, že LACTB je svým vlastním...
|
|
|
Role WSS1 proteasy v DNA reparačních procesech kvasinkové buňky.
Adámek, Michael ; Grantz Šašková, Klára (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
Zachování integrity DNA je v průběhu života kritické pro každý živý organismus. Organismy si proto vyvinuly mnoho způsobů, jak detekovat a opravit různé typy poškození DNA, způsobené endogenními i exogenními vlivy, vyúsťující dále v replikační stres. Chyby v těchto opravných mechanismech mohou vést k závažným lidským onemocněním, jako jsou neurologické poruchy, familiární druhy onkologických onemocnění nebo vývojové syndromy. V této diplomové práci byla zkoumána funkce kvasinkového proteinu Wss1, metaloproteasy, která se podílí na nedávno objevené DNA opravné dráze, která proteolyticky odstraňuje proteiny kovalentně zachycené na zuje silnou negativní interakci s jinou proteasou opravující DNA, Ddi1, přičemž bylo objeveno, že kvasinkový kmen postrádající současně geny je hypersenzitivní na hydroxyureu. Hydroxyurea inhibuje ribonukleotidreduktasu, čímž v konečném důsledk způsobuje zastavení buňky v fázi buněčného cyklu. V rámci této diplomové práce byly na základě předchozích studií provedeny tzv. "rescue" experimenty s různými variantami Wss1, postrádajícími jednotlivé domény či obsahujícími bodové aminokyselinové záměny. Tyto experimenty následně posloužily k posouzení účasti jednotlivých domén proteinu Wss1 v odpovědi na replikační stres vyvolaný hydroxymočovinou.
|
|
|
Analysis of secretome from Trichobilharzia regenti cercariae and characterisation of selected peptidases
Konečný, Lukáš ; Kašný, Martin (vedoucí práce) ; Horn, Martin (oponent)
(česky): Motolice Trichobilharzia regenti je neurotropní parazit ptáků z rodiny Schistosomatidae. Cerkárie, invazivní stadium těchto motolic, využívají k aktivní penetraci hostitele exkrečně-sekreční produkty, které obsahují proteolytické enzymy schopné narušit tkáně hostitele zaručit tak úspěšný přenos. Nejvíce zastoupeným enzymem zodpovědným za penetraci cerkárií lidské schistosomy S. mansoni je cerkáriová elastáza. Tato serinová peptidáza je dobře známá pro degradaci kožních proteinů jako je elastin, keratin, kolagen nebo laminin, avšak, aktivní exprese ortologu tohoto enzymu nebyla u rodu Trichobilharzia nikdy prokázána. Z tohoto důvodu panovalo pevné přesvědčení, že cerkárie T. regenti používá k invazi hostitele zejména cysteinové peptidázy, zvláště katepsiny, které byly opakovaně identifikovány v tomto životním stádiu. Abychom posílili tuto hypotézu. inkubovali jsme cerkárie T. regenti v sestavě využívající kachní kůži jakožto stimulant pro vyprázdnění penetračních žláz. Získané ESPs byly analyzovány hmotnostní spektrometrií a poprvé se nám tak podařilo identifikovat proteinovou formu cerkáriové elastázy T. regenti. Produkce aktivního rekombinantního proteinu se bohužel nezdařila v bakteriálním ani kvasinkovém expresním systému, nicméně, naše sekretomická studie společně s dodatečnou qPCR...
|
|
|
Proteolytické systémy krevničky střevní (Schistosoma mansoni).
Fajtová, Pavla ; Horn, Martin (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent) ; Sojka, Daniel (oponent)
Schistosomóza je závažné parazitární onemocnění člověka, jehož původcem jsou krevničky, krevní motolice rodu Schistosoma. Celosvětově je schistosomózou, která představuje globální světový problém, infikováno přes 200 miliónů lidí a dalších 750 miliónů je vystaveno riziku nákazy. Jediný účinný lék pro léčbu schistosomózy je chemoterapeutikum praziquantel, u kterého je riziko vzniku rezistence. Proteasy krevničky představuji nadějné cílové molekuly pro vývoj nových terapeutických strategií proti schistosomóze. Tato práce se zaměřuje na komplexní charakterizaci proteolytických systémů krevničky Schistosoma mansoni a určení jejich role v interakci s hostitelem. Za prvé byly pomocí metod funkční proteomiky popsány hlavní proteolytické aktivity sekretované jednotlivými vývojovými stádii krevničky, která parazitují v těle člověka. Tato analýza prokázala jejich komplexní a specifickou distribuci s převažujícími serinovými a cysteinovými proteasami a metaloproteasami. Za druhé byly pomocí přístupu chemické genomiky identifikovány povrchové a trávicí proteasy krevničky, konkrétně prolyloligopeptidasa a katepsiny typu B, C a D, jako vhodné cílové molekuly pro terapeutickou intervenci. Prolyloligopeptidasa byla biochemicky charakterizována na úrovni rekombinantního proteinu, byly vyvinuty její účinné...
|
|
|
Nestrukturní proteiny virů Zika a Dengue s enzymovou aktivitou.
Krýsová, Eliška ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Novotný, Marian (oponent)
Viry Zika a Dengue kódují vlastní enzymy, které jsou aktivní v různých stádiích replikačního cyklu. NS3, NS5 protein a jejich kofaktory hrají nepostradatelnou roli ve fungování flavivirů. I když byly struktury těchto proteinů již vyřešeny, jejich vlastnosti jsou prozkoumány jen částečně a mnoho aspektů ohledně jejich funkce zůstává nevyřešeno. Hlavními tématy této práce je úloha NS3 a NS5 proteinu v životním cyklu virů Zika a Dengue, sestřih polyproteinového prekurzoru, samotná replikace a interakce těchto enzymů s dalšími strukturními a nestrukturními proteiny. NS3 a NS5 protein mají mnoho enzymatických aktivit strukturně i funkčně oddělených, což je činí zajímavými z hlediska výzkumu autoaktivace, interakce funkčních domén a proteinů mezi sebou. Jelikož jsou infekce viry Zika a Dengue stále velmi vážným problémem, je nezbytné co nejlépe pochopit molekulární mechanismy jejich replikace. Klíčová slova: proteasa, polymerasa, Zika, Dengue, sestřih polyproteinů, protivirová terapie
|
|
|
Ddi1-like proteins: a novel family of retroviral-like aspartyl proteases
Šmilauerová, Kristýna ; Grantz Šašková, Klára (vedoucí práce) ; Šmahel, Michal (oponent)
Ubikvitin-proteasomový systém je jedním z klíčových procesů podílejících se na udržení homeostáze buňky. Jeho hlavním úkolem je degradovat poškozené, špatně sbalené či nepotřebné proteiny. Podílí se ale také na celé řadě dalších procesů jako jsou například opravy DNA, regulace buněčného cyklu či signalizace. Celý systém se skládá z mnoha komponent, které jsou vzájemně úzce regulovány. Jednou ze skupin účastnících se ubikvitin- proteasomového systému jsou tzv. proteasomové adaptorové proteiny. Ty rozpoznávají substráty určené k degradaci a transportují je k proteasomu - místu degradace. Mezi tyto proteiny se řadí i rodina Ddi1 podobných proteinů (z angl. DNA damage-inducible protein 1), která se vyznačuje doménou podobnou retrovirovým aspartátovým proteasam. Biologické funkce této proteinové rodiny jsou objasněny jen částečně, a to zejména u Ddi1 pocházející z kvasinky Sacharomyces cerevisiae, a jsou proto předmětem aktivního výzkumu. Tato práce shrnuje dosavadní poznatky a publikované informace o této proteinové rodině, popisuje její obecné charakteristiky, známé funkce, zasazuje je do kontextu buněčných procesů a tím poukazuje na další možné směry výzkumu.
|
host ::
RSS.