|
|
Signaling effects of adenylate cyclase toxin action on phagocytes
Černý, Ondřej
Adenylát-cyklázový toxin (CyaA) je klíčovým faktorem virulence bakterie Bordetella pertussis. CyaA se váže na fagocyty produkující komplementový receptor 3 (CR3) a následně katalyzuje přeměnu vnitrobuněčného ATP na významného "druhého posla" cAMP. Tímto paralyzuje schopnost neutrofilů a makrofágů zabíjet bakterie pomocí oxidativního vzplanutí a mechanismů závislých na fagocytóze. V této práci analyzujeme mechanismus, kterým CyaA blokuje produkci baktericidních reaktivních kyslíkových a dusíkových radikálů neutrofily a makrofágy. CyaA potlačuje produkci reaktivních kyslíkových radikálů (ROS, z angl. "reactive oxygen species") jednak prostřednictvím inhibice PLC přes PKA a dále nejspíše ovlivněním skládání komplexu NADPH oxidázy prostřednictvím aktivace proteinu Epac. Selektivní aktivace PKA nebo Epac blokovala produkci ROS indukovanou fMLP. Inhibice PKA pomocí specifických inhibitorů navíc vedla jen k částečnému obnovení produkce ROS u neutrofilů vystavených CyaA. Signalizace CyaA/cAMP následně omezila tvorbu DAG, zatímco tvorba PIP3 zůstala neovlivněna. Tyto výsledky naznačují, že působení CyaA může ovlivnit lipidické složení membrány fagocytů. Dále jsme ukázali, že aktivace PKA pomocí cAMP vyvolává aktivaci tyrozínové fosfatázy SHP-1. To v makrofázích způsobí potlačení produkce reaktivních...
|
|
|
Pórotvorné vlastnosti toxinu CyaA bakterie Bordetella pertussis a složení membránové dvojvrstvy.
Rädisch, Robert ; Konopásek, Ivo (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Bordetella pertussis produkuje mnoho virulenčních faktorů mezi které patří adenylát- cyklázový toxin (ACT, CyaA). Tento toxin preferenčně napadá buňky imunitního systému, které mají integrinový receptor CD11b/CD18, a způsobuje tak oslabení imunitního systému hostitele. Na napadené buňky působí CyaA dvěma způsoby: 1) CyaA vytváří v membráně napadené buňky kationt-selektivní póry a způsobuje tak koloidně osmotickou lýzi napadené buňky, 2) CyaA způsobuje konverzi cytosolického ATP na signální molekulu cAMP, což způsobuje ztrátu fyziologických funkcí napadené buňky a taktéž vede k buněčné smrti. Cílem mé práce bylo otestovat vhodnost nového modelového systému ze syntetických lipidů - difytanoylů, pro charakterizaci pórotvorných vlastností adenylát-cyklázového toxinu. V minulosti se k charakterizaci využíval modelový systém z azolektinu, který je složen z mnoha různých lipidů a je tak příliš komplexní pro zjišťování úlohy jednotlivých lipidů. Dále byl zjišťován vliv cholesterolu na aktivitu adenylát-cyklázového toxinu v tomto systému, protože bylo zjištěno, že k translokaci adenylát-cyklázové domény dochází v lipidových raftech, které jsou bohaté na cholesterol. Posledním cílem mé diplomové práce bylo charakterizovat mnou nově objevený typ kanálu s dvěma vodivostními stavy. Klíčová slova: Bordetella...
|
|
|
Úloha RTX domény v aktivitě adenylátcyklázového toxinu z Bordetella pertussis
Klímová, Nela ; Bumba, Ladislav (vedoucí práce) ; Konopásek, Ivo (oponent)
Adenylátcyklázový toxin (CyaA) bakterie Bordetella pertussis je protein sestávající z 1706 aminokyselin, obsahující na svém N-konci enzymatickou adenylátcyklázovou (AC) doménu a na C-konci repetitivní RTX (z angl. Repeat-in-Toxin) doménu. Přítomnost RTX domény řadí CyaA do rodiny tzv. RTX proteinů, sekretovaných z cytosolu gramnegativních bakterií sekrečním aparátem typu I (T1SS). RTX doména CyaA se skládá z pěti bloků nonapeptidových RTX repetic s konsenzuální sekvencí X-(L/I/V)-X-G-G-X-G-X-D. Cílem této práce bylo určit úlohu RTX domény v biologické aktivitě CyaA a její vliv na sekreci toxinu z buněk Bordetella pertussis. Systematická deleční analýza bloků RTX repetic ukázala, že žádná z připravených delečních variant toxinu nebyla schopna translokovat AC doménu přes cytoplazmatickou membránu do cytosolu cílových buněk a tvořit póry v membránách těchto buněk. Odstranění jednotlivých bloků RTX repetic vedlo navíc k nízké efektivitě sekrece mutant do vnějšího prostředí bakterie. Z těchto dat vyplývá, že strukturní celistvost RTX domény CyaA hraje klíčovou úlohu nejen v cytotoxické aktivitě proteinu, ale napomáhá i při jeho sekreci přes T1SS.
|
|
|
Mechanismus sekrece adenylát cyklázového toxinu Bordetella pertussis pomocí sekrečního aparátu typu I (TISS)
Klímová, Nela ; Bumba, Ladislav (vedoucí práce) ; Konopásek, Ivo (oponent)
Sekreční aparát typu I gramnegativních bakterií umožňuje transport proteinů z cytoplasmy do extracelulárního prostoru přes vnitřní i vnější membránu v jednom kroku. Transmembránový kanál je složen pouze ze tří proteinů - ATPázy ve vnitřní membráně, fúzního proteinu a specifického proteinu ve vnější membráně. Tato práce podává přehled současných znalostí o struktuře tohoto sekrečního aparátu, formování komplexu v membráně a o mechanismu sekrece proteinu. Zdůrazněna je role sbalování proteinu na sekreci. Dále je nastíněna charakteristika substrátů sekrečního aparátu typu I, se zaměřením na adenylátcyklázový toxin bakterie Bordetella pertusis, původce černého kašle.
|
|
|
Adenylát cyklázový toxin bakterie Bordetella pertussis, jeho konformace a iontová rovnováha v hostitelské buňce.
Motlová, Lucia ; Konopásek, Ivo (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Adenylát-cyklázový (CyaA, ACT) toxin je jedním z hlavních virulenčních faktorů bakterie Bordetella pertussis. Ačkoli se CyaA váže na mnoho typů membrán, předpokládá se, že jeho receptorem je integrin CD11b/CD18, který je exprimován na povrchu myeloidních buněk. CyaA patří do rodiny RTX toxinů-hemolyzinů. CyaA působí na hostitelské buňky dvěma na sobě nezávislými aktivitami. Jednou z nich je přeměna ATP na cyklické AMP, kterou zajišťuje adenylát-cyklázová (AC) doména po translokaci do cytozolu hostitelské buňky, při které dochází ke vstupu vápenatých kationtů do hostitelské buňky. Translokace je pravděpodobně iniciována interakcí monomeru CyaA s cílovou membránou. Druhá aktivita CyaA je tvorba kanálu, selektivního pro kationty, který může způsobit koloidně osmotickou lyzi cílových buněk. Kanálo-tvorná aktivita je zajišťována RTX hemolyzinovou doménou a předpokládá se u ní oligomerizace, i když bylo zjištěno, že únik draselných kationtů z hostitelské buňky způsobuje CyaA ve formě monomeru. Také není jasné, zda by k oligomerizaci CyaA docházelo v roztoku, nebo až po interakci s hostitelskou membránou. Cílem této práce bylo zkoumat tok sodných iontů na membráně myších makrofágů J774A.1, které na svém povrchu exprimují CD11b/CD18 integrin. Pro dosažení tohoto cíle byly použity fluorescenční metody....
|
|
|
Adenylátcyklázový toxin Bordetella pertussis jako marker pro studium endocytózy komplementového receptoru CD11b/CD18.
Chvojková, Věra ; Bumba, Ladislav (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent)
Bordetella pertussis způsobuje u lidí infekční onemocnění nazývané černý kašel. Tato gram-negativní bakterie produkuje adenylátcyklázový toxin (CyaA), který se váže na integrinový receptor CD11b/CD18 na povrchu myeloidních fagocytů a dopravuje do jejich cytosolu adenylátcyklázovou doménu (AC). Tato práce se zabývá studiem endocytózy CyaA a jeho využití jako specifické značky při studiu endocytické dráhy CD11b/CD18 receptoru. Detoxifikovaná verze toxinu, CyaA-AC- , jenž je schopna zvyšovat intracelulární koncentraci vápenatých iontů a zároveň umožňuje únik draselných iontů z buňky, způsobuje aktivaci integrinového receptoru CD11b/CD18, což vede k následné endocytóze prostřednictvím dráhy závislé na klatrinu. Na druhou stranu, inaktivní mutanta CyaA-KP-AC- nespouští aktivaci receptoru a je endocytována prostřednictvím jiné dráhy, která je na klatrinu nezávislá. Tyto data naznačují, že mechanismus endocytózy CD11b/CD18 je určován a regulován odlišnými konformačními stavy tohoto receptoru.
|
|
|
Assessing biochemical properties of PDE8A1: Design of experimental system in living cells"
Galica, Tomáš ; Černý, Jan (vedoucí práce) ; Mašek, Tomáš (oponent)
5 Abstrakt Fosfodiesterázy sú dôležitou súčasťou signálnych dráh eukaryotických buniek. Druhý posol 3'-5'-cyklický adenozín monofosfát (cAMP) je hydrolyzovaný špecifickými fosfodiesterázami. Kontrolou hladiny cAMP v bunke fosfodiesterázy zabezpečujú vhodné prostredie pre prenos cAMP signálu. Navyše, ako odpoveď na zvýšenú hladinu cAMP, sú fosfodiesterázy aktivované proteín kinázou A (PKA), čo je vlastnosť dôležitá obzvlášť pre patričné ukončenie signálu. Fosfodiesteráza 8A (PDE8A1) je vysoko-afinitná cAMP-špecifcká fosfodiesteráza necitlivá k inhibícii pomocou IBMX. Je významný enzýmom pre cAMP signalizáciu, avšak najmä kvôli nedostupnosti PDE8A špecifického inhibítoru, jej úloha ešte nebola detailne preskúmaná ani docenená. Prezentovaná práca zahŕňa klonovanie PDE8A1, identifikáciu jej posttranslačných modifikácii, lokalizáciu na bunkovej úrovni ako aj alternatívny prístup ku skúmania fosfodiesteráz pomocou cyklázového toxínu z Bordetelly pertussis. Kľúčové slová: fosfodiesteráza, cAMP, posttranslačné modifikácie, myristoylácia, palmitoylácia, adenylátcyklázový toxín
|
|
|
Immunomodulation of dendritic cells by adenylate cyclase toxin from B. pertussis
Jáňová, Hana ; Brdička, Tomáš (oponent) ; Adkins, Irena (vedoucí práce)
Bordetella pertusis je gram-negativní bakterie, která způsobuje onemocnění černý kašel. Mezi hlavní faktory virulence této bakterie se řadí adenylát cyklázový toxin (CyaA), který se uplatňuje v kolonizaci hostitele. Toxin se váže s vysokou afinitou na myeloidní fagocyty nesoucí na svém povrchu CD11b/CD18 integrin, proniká do jejich cytosolu a negativně ovlivňuje jejich schopnost fagocytosy, chemotaxe a oxidativního vzplanutí. Dále také CyaA ovlivňuje spektrum sekretovaných cytokinů u dendritických buněk (DC) stimulovaných LPS a moduluje jejich maturaci tím, že působí na expresi ko-stimulačních molekul. V této práci jsme se zabývali vlivem CyaA toxinu na schopnost myších DC z kostní dřeně presentovat ovalbuminové epitopy vnesené CyaA-AC- toxoidem a aktivovat CD4+ a CD8+ T-buňky. Dále jsme se snažili zjistit, zda DC ovlivněné působením CyaA snižují CD4+ T buněčnou odpověď v důsledku sníženého antigenního příjmu nebo jeho zpracování pro presentaci na MHC molekulách II. třídy. CyaA také snižuje CD8+ T-buněčné odpovědi, proto jsme se zaměřili na vliv toxinu na proteolytickou aktivitu proteasomu a na možné ovlivnění prezentace peptidů na MHC molekulách I. třídy. Zjistili jsme, že zvýšená hladina cAMP v DC snižuje presentaci ovalbuminových epitopů vnesených CyaA-AC- toxoidem na MHC molekulách I. a II....
|
|
|
Příprava a charakterizace rekombinantního adenylát cyklázového toxoidu bakterie Bordetella pertussis nesoucího mykobakteriální antigen TB7.7
Mikulecký, Pavel ; Vopálenský, Václav (oponent) ; Staněk, Ondřej (vedoucí práce)
Bakterie Mycobacterium tuberculosis je původcem smrtelné nemoci nazývané tuberkulóza představující celosvětový problém. Předpokládá se, že na světě žijí až dvě miliardy infikovaných lidí, u kterých bakterie přetrvává ve své latentní fázi. Specifická, citlivá, rychlá a ekonomicky dostupná metoda pro identifikaci nakažených jedinců je stále žádaná. V současné době se jako nejlepší varianta diagnostického přístupu jeví in vitro krevní testy, ve kterých se pro restimulaci specifických T lymfocytů používají mykobakteriální antigeny odvozené od virulentního kmene. Pro zvýšení efektivity dopravy antigenů do antigen prezentujících buněk se testuje mnoho přístupů, přičemž jedním z nich je geneticky detoxifikovaný adenylát cyklázový toxin (CyaA) bakterie Bordetella pertussis. Předkládaná práce se zabývá přípravou a následnou charakterizací biologických vlastností CyaA proteinu, který ve své translokační doméně nese mykobakteriální antigen TB7.7. Experimentální výsledky ukazují, že fúzní protein CyaA-TB7.7 má zachovanou kanálotvornou aktivitu a je schopen dopravit antigeny na povrch APC s molekulami MHC II. Detoxifikovaný CyaA protein s vloženým mykobakteriálním antigenem TB7.7 bude použit pro doplnění současně testovaných přístupů, kterým je i in vitro restimulace krevních vzorků, a sloužit tak jako další...
|
|
|
Signalizace adenylátcyklázového toxinu bakterie Bordetella pertussis v makrofázích.
Černý, Ondřej ; Kuthan, Martin (oponent) ; Kamanová, Jana (vedoucí práce)
Souhrn Adenylátcyklázový toxin je klíčovým faktorem virulence bakterie Bordetella pertussis, která způsobuje onemocnění černý kašel. Primárním cílem tohoto toxinu v hostitelském organismu jsou myeloidní fagocytické buňky nesoucí integrin CD11b/CD18 (αMβ2, CR3, Mac-1). Již dříve bylo ukázáno, že CyaA inhibuje zvýšením hladiny cytozolického cAMP schopnost makropinocytózy a fagocytózy v buňkách. Tato práce se zabývá studiem signální dráhy, která je zodpovědná za inhibici makropinocytózy právě přes zvýšenou vnitrobuněčnou koncentraci cAMP. Pomocí specifických aktivátorů proteinové kinázy A (PKA) a proteinu Epac jsme ukázali, že za inhibici makropinocytózy v buňkách je zodpovědná zvýšená vnitrobuněčná hladina cAMP, která dále vedla k aktivaci proteinu Epac. Dále jsme prokázali, že transfekce makrofágů konstitutivně aktivní variantou proteinu Rap1 (efektorem proteinu Epac) vedla k inhibici makropinocytózy. Naopak, exprese dominantně negativní varianty Rap1 vyvolala zvýšení makropinocytózy. Dále jsme ukázali, že inhibice jak tyrozínových fosfatáz, tak proteinové fosfatázy 2A (PP2A) vedla k obnově makropinocytózy, která byla před tím inhibovaná zvýšenou hladinou cAMP v buňkách. Získané výsledky naznačují, že signalizace cAMP přes proteiny Epac/Rap1, případně přes proteinovou fosfatázu 2A a tyrozínové fosfatázy vede...
|
host ::
RSS.