|
|
Příprava konstruktů pro izolaci proteinů a jejich testování
Osadchuk, Olha ; Kostovová, Iveta (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Tato práce je zaměřená na popis produkce rekombinantních proteinu. Pro studium dané problematiky byl zvolen protein p53, který je jedním z hlavních nádorových supresorových proteinu. Protein p53 je zodpovědný za regulaci mnoha genů, které mohou kontrolovat buněčný cyklus a replikaci DNA, a je nejčastěji mutovaným genem u nádorových onemocněni člověka. Pro danou prací byly zvolený různé varianty bodových mutaci proteinů p53, které mohou ovlivnit jeho vazebné vlastnosti a funkce. Znalosti mechanizmu působení mutovaných p53 proteinů v buňce je důležité pro efektivní léčbu rakoviny. V teoretické části jsou popsaný vlastnosti proteinu a jednotlivé expresní systémy, metody Gateway klonováni, a metody použité při purifikaci a izolaci proteinů (afinitní chromatografie, SDS-PAGE analýza a Western blot analýza). V experimentální časti jsou popsané postupy přípravy expresních vektoru pomoci Gateway technologie, transformace do buněk a izolace plazmidové DNA. Klonováním byly připraveny tři expresních klony a po jejich transformace do kompetentních buněk byla provedena izolace DNA.
|
|
|
Studium extracelulární části myšího receptoru Nkr-p1b přirozených zabíječských buněk pomocí NMR
Skála, Kristián ; Chmelík, Josef (vedoucí práce) ; Martínek, Václav (oponent)
Protein Nkr-p1b je povrchový receptor cytotoxických NK buněk, který zprostředkovává inhibiční signál vůči buňkám tělu vlastním. V rámci této práce byla pomocí rekombinantní exprese v buňkách E. coli připravena ligand vazebná doména myšího proteinového receptoru Nkr-p1b (mNkr-p1b LBD), která byla následně použita pro NMR strukturní analýzu. Pomocí třech různých metod (CD, PSIPRED a TALOS) bylo určeno zastoupení sekundárních struktur v molekule proteinu. Získané procentuální zastoupení sekundárních struktur přibližně odpovídá struktuře CTLD domény, která je důležitá pro vazbu ligandu, a tedy funkci receptoru Nkr-p1b. Daný protein se podařilo připravit ve formě vhodné pro NMR experimenty. Na základě dat získaných analýzou NMR spekter byl vytvořen předběžný model struktury proteinu mNkr-p1b LBD. Pro přesnější učení 3D struktury však ještě bude v dalších fázích potřeba vyhodnotit další NMR spektra, a upřesnit tak polohu jednotlivých atomů v molekule proteinu. Rozluštění struktury LBD domény proteinu mNkr-p1b by mohlo pomoci lépe pochopit komplexní mechanizmus aktivace NK buněčné cytotoxické aktivity, a tím přispět k jejímu řízenému využití jako terapeutika proti některým virovým a nádorovým onemocněním.
|
|
|
Příprava a biochemická charakterizace proteasového inhibitoru equistatinu
Polatová, Daniela ; Mareš, Michael (vedoucí práce) ; Bořek Dohalská, Lucie (oponent)
Equistatin ze sasanky koňské (Actinia equina) obsahuje proteinovou doménu Eqd2, která inhibuje aspartátové peptidasy, ale dosud nebyla detailně charakterizována. Rekombinantní Eqd2 byl připraven v kvasinkovém expresním systému a byl navržen protokol pro jeho chromatografickou purifikaci. Pomocí fluorescenčního inhibičního testu byla určena inhibiční specifita Eqd2, která ukázala, že je vysoce selektivním inhibitorem peptidas typu katepsinu D a pepsinu z rodiny aspartátových peptidas A1. Dále byla pomocí gelové chromatografie analyzována tvorba komplexu Eqd2-peptidasa a oligomerizace Eqd2 v roztoku. Za účelem budoucí rentgenostrukturní analýzy Eqd2 byla provedena primární analýza krystalizačních podmínek. Tato práce přináší nové významné informace o Eqd2 jako unikátním typu přirozených inhibitorů aspartátových peptidas. Lze předpokládat, že určení interakčního mechanismu Eqd2 umožní navrhovat jeho syntetická mimetika pro regulaci medicinálně významných peptidas. Klíčová slova: peptidasové inhibitory, proteolytické enzymy, aktivita a inhibice enzymů, rekombinantní exprese, purifikace proteinů, krystalizace proteinů, equistatin
|
|
|
Rekombinantní příprava transkripčního faktoru TEAD.
Lišková, Růžena ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Staněk, Ondřej (oponent)
Rekombinantní příprava transkripčního faktoru TEAD (abstrakt) Transkripční faktory z TEAD rodiny hrají v organismu důležitou roli během jeho vývoje, kdy aktivují expresi proteinů ovlivňujících růst a diferenciaci buněk a také proteinů bránících apoptose, čímž regulují velikost orgánů. Aktivita TEAD proteinů je regulována prostřednictvím signálních drah a interakcí s koaktivátory a porucha těchto regulačních mechanismů může způsobit vznik nádorových onemocnění. Z toho důvodu jsou TEAD proteiny zajímavým cílem pro vývoj nových protirakovinných léčiv založených na inhibici jejich aktivity. Jednou z možností, jak inhibovat aktivitu transkripčního faktoru, je zabránit jeho vazbě na DNA. Pro navržení nového léčiva bránícího vazbě transkripčního faktoru na DNA je nejprve potřeba přesně znát strukturní podstatu interakce těchto dvou molekul. V této práci byla připravena DNA vazebná doména lidského proteinu TEAD1 postupem rekombinantní exprese v bakterii E. coli. Byly nalezeny vhodné podmínky produkce a připravovaný protein byl purifikován do dostatečné čistoty pro strukturní analýzu jeho interakcí s DNA.
|
|
|
Substrate cleavage by mammalian Dicer isoforms
Kubíková, Jana ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Pospíšek, Martin (oponent)
Hostitelské organismy vyvinuly řadu antivirových odpovědí, které rozpoznávají a potlačují virovou infekci. Jedním ze znaků virové infekce je i přítomnost dvouvláknové RNA v buňce. Jedna z drah odpovídajících na dvouvláknovou RNA je RNA interference, která představuje klíčovou složku antivirové obrany u bezobratlých živočichů a rostlin. Savci využívají pro obranu před viry odlišnou dráhu, která rozpoznává dvouvláknovou RNA, nazývající se interferonová odpověd. RNA interference funguje jen v savčích oocytech a raných embryonálních stádiích, ačkoliv potřebné enzymové vybavení se nachází ve všech somatických buňkách, protože je využíváno mikroRNA dráhou. Předchozí studie ukázala, že funkčnost RNA interference v myších oocytech souvisí s přítomností oocytární isoformy Diceru (DicerO ), jež je zkrácená na N-konci. V této práci jsem se zaměřila na zhodnocení, zda DicerO zpracovává substráty typické pro RNA interferenci účinněji než nezkrácená isoforma Diceru (DicerS ), která se nachází v somatických buňkách. Za tímto účelem jsem vyvinula protokol na purifikaci Diceru, abych získala obě myší isoformy Diceru o vysoké čistotě. Následně jsem otestovala jejich aktivitu v neradioaktivní enzymové analýze na různých substrátech se strukturními prvky charakteristickými pro substráty RNA interference. Získané výsledky...
|
|
|
Rekombinantní expresse chloridového kanálu z E. coli a jeho strukturní charakterizace
Hausner, Jiří ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Vrbacký, Marek (oponent)
Proteinová rodina chloridových kanálů zastává významnou funkci pro fyziologické pochody v organismu. Mechanismus jejich působení však ještě nebyl zcela vyřešen. Poškození, či mutace těchto proteinů vyvolávají závažná onemocnění, k jejichž léčbě by mohlo pomoci právě popsání transportních mechanismů těchto kanálů. Jelikož se savčí chloridové kanály obtížně produkují, jsou experimenty prováděny na prokaryotických variantách, jejichž struktura je známa a produkují se s vysokým výtěžkem. Většina experimentů je dnes prováděna staticky pomocí krystalografie. V této práci jsme se zaměřili na studium strukturních změn chloridového kanálu z E. coli pomocí vodík/deuteriové výměny. Tato metoda umožňuje dynamicky sledovat změny konformace proteinu v závislosti na pH a navázaných iontech. Experimenty byly prováděny za protonovaného (pH 4,5) a deprotonovaného stavu (pH 7,5) a za přítomnosti rozličných aniontů: Cl− , SCN− , I− , F− , TAR.(tartarový aniont). Data, která jsme získali, potvrzují některé teorie ohledně funkce chloridového kanálu jako Cl− /H+ antiporteru a přinášejí i nové poznatky. Předmětová slova biochemie, struktura proteinů, vodík/deuteriová výměna, hmotnostní spektrometrie Klíčová slova chloridový kanál, hmotnostní spektrometrie, vodík/deuteriová výměna, rekombinantní exprese, purifikace proteinů,
|
host ::
RSS.