|
|
Studium akumulace polyhydroxyalkanoátů u cyanobakterií
Pacasová, Viktorie-Alexandra ; Slaninová, Eva (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Předložená bakalářská práce je zaměřená na studium vlivu vybraných stresových faktorů na produkci PHB u kmenů cyanobakterií Synechocystis sp. PCC 6803 a Synechocystis salina CCALA 192. Cyanobakterie byly kultivovány v multikultivátoru a jako stresový faktor byl použit zvýšený obsah soli (chloridu sodného) nebo směs acetátu a -butyrolaktonu v kultivačním médiu. Obsah PHB v jednotlivých cyanobakteriích byl stanovován pomocí plynové chromatografie, přítomnost a množství barviv byla stanovována pomocí extrakce barviv a pomocí přímé spektrofotometrické analýzy. Získané výsledky nepotvrdily hypotézu o zvýšení produkce PHB při kultivaci cyanobakterií v prostředí se zvýšeným obsahem soli. Příčinou tohoto zjištění je pravděpodobně společné působení několika stresových faktorů jako zvýšený obsah soli, kontinuální osvětlení v multikultivátoru a limitace dusíkem, díky použitému typu média, na kultury Synechocystis salina CCALA. Při kultivaci se směsí acetátu a -butyrolaktonu byly kultury analyzovány stejným způsobem, jako v případě prostředí se zvýšeným obsahem soli, a byla stanovována i přítomnost kopolymeru 3-hydroxybutyrátu a 4-hydroxybutyrátu. Během této kultivace byl rovněž pozorován pozitivní vliv kombinace působení kontinuálního osvětlení, typu média limitujícího dusík a výchozí koncentrace buněk v kulturách na rychlost růstu vybraných kmenů cyanobakterií.
|
|
|
Evoluční inženýrství cyanobakterií v kontextu akumulace PHA
Vašířová, Kristýna ; Slaninová, Eva (oponent) ; Samek, Ota (vedoucí práce)
Cílem této diplomové práce bylo podrobit vybrané cyanobakteriální kmeny adaptivní evoluci a následně prozkoumat vlastnosti vzniklých adaptovaných kmenů, obzvlášť jejich změny týkající se akumulace polyhydroxyalkanoátů (PHA). Teoretická část práce blíže charakterizuje problematiku cyanobakterií, PHA a jejich vzájemné propojení v oblasti evolučního inženýrství. Pro evoluční experimenty byly použity cyanobakteriální kmeny Synechocystis sp. PCC 6803 a Synechocystis salina CCALA 192. Na vybrané zástupce byly vyvíjeny selekční tlaky působením peroxidu vodíku a mědi. Vzniklé kultury a jejich schopnost akumulace PHA byly následně posouzeny metodou plynové chromatografie. Oba tyto zvolené selekční tlaky se ukázaly jako nevhodné, jelikož po jejich aplikaci na kultury byla pozorována vysoká inhibice růstu neumožňující aplikace metod evolučního inženýrství. V druhé půlce experimentální části byly sledovány poskytnuté adaptované kmeny na 6% NaCl. Prokázalo se, že adaptace má na mikroorganismy pozitivní vliv, jelikož vykazovaly lepší růst biomasy, vyšší odolnost při odolávání stresovým podmínkám a bylo pozorováno nepatrné navýšení akumulace PHA.
|
|
|
Molekulárně biologická charakterizace vybraných producentů PHA
Kubáčková, Eliška ; Brázda, Václav (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Diplomová práce se zabývá molekulárně biologickou charakterizací vybraných producentů polyhydroxyalkanoátů (PHA). V rámci práce byly pomocí molekulárně biologických metod identifikovány a charakterizovány PHA produkující termofilní izoláty pocházející ze vzorků aktivovaného kalu a kompostu. Sekvenací 16S rRNA genu byly termofilní izoláty identifikovány a taxonomicky zařazeny do kmene bakterií Firmicutes. U těchto bakteriálních izolátů byla stanovena schopnost produkce PHA na úrovni genotypu pomocí konvenční PCR detekcí phaC genu kódujícího PHA syntázu, který je klíčovým enzymem biosyntézy PHA. U většiny izolovaných bakterií byly detekovány PHA syntázy I., II. a IV. třídy, přičemž PHA syntázy tříd I a II nejsou pro detekované rody bakterií charakteristické. Největšího zastoupení izolátů představoval druh termofilní bakterie Aneurinibacillus thermoaerophilus, u kterého byla detekována PHA syntáza IV. třídy. V druhé části diplomové práce byla zavedena metoda RT-qPCR pro studium exprese vybraných genů bakterie Cupriavidus necator H16 zapojených do metabolismu PHA. V rámci zavedení metody byla provedena optimalizace PCR detekce vybraných genů a optimalizována kvantifikace genů pomocí real-time PCR. Testovaná metoda zahrnovala kroky izolace RNA, syntézu cDNA a kvantifikaci úseků genů, u nichž byly na základě získaných dat stanoveny kritické body metody.
|
|
|
Souvislost mezi schopností bakterií odolávat teplotnímu stresu a akumulovat PHA
Nováčková, Ivana ; Benešová, Pavla (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Bakalářská práce se zabývá zapojením polyhydroxyalkanoátů (PHA) do stresové odpovědi bakterií, a to konkrétně při působení teplotního stresu. Teoretická část práce se zaměřuje na stresovou odpověď bakterií obecně, na mechanismus odpovědi vůči teplotnímu stresu a na zapojení PHA do stresové odpovědi. V rámci experimentální práce byla zkoumána souvislost mezi množstvím PHA v biomase bakterií a jejich viabilitě po působení teplotního stresu. Pro práci byly využity PHA produkující kmeny Cupriavidus necator H16, Burkholderia cepacia a Burkholderia sacchari a PHA neprodukující mutantní kmen Cupriavidus necator PHB4. Bakterie akumulovaly poly(3-hydroxybutyrát) (PHB), přičemž jeho množství v biomase bylo stanovováno pomocí plynové chromatografie s FID. Viabilita živých bakteriálních buněk i buněk po expozici teplotním stresům byla stanovována pomocí průtokové cytometrie. Ukázalo se, že obsah PHB v biomase napomáhal bakteriím odolávat mrazovému šoku. Na základě porovnání viability bakterií C. necator H16 a C. necator PHB4 po expozici kombinovaným stresům bylo rovněž pozorováno, že PHB zvyšoval odolnost buněk vůči teplotnímu stresu a stresu způsobenému nízkým pH.
|
|
|
Regulace produkce polyhydroxybutyrátu bakterií Wautersia eutropha
Grossová, Marie ; Čarnecká, Martina (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Cílem práce je studium možností mikrobiální produkce polymerů používaných jako biodegradabilní materiály (polyhydroxyalkanoáty; konkrétně polyhydroxybutyrát PHB). Pro laboratorní produkci PHB byla využita průmyslově užívaná bakterie Wautersia eutropha, u které byla studována možnost zvýšení produkce PHB s využitím exogenních stresových faktorů (osmotického šoku, peroxidu a etanolu). Působení exogenního stresu na bakteriální kulturu závisí na koncentraci stresového faktoru, době aplikace stresu, přičemž zásadní vliv na výtěžky PHB má změna produkce biomasy. Významná část práce se zabývá studiem produkce PHB v bakteriálních buňkách vystavených stresu v různých fázích růstu. Aplikace silného stresu v ranné fázi kultivace vede k potlačení produkce PHB i biomasy. Nejvhodnější je aplikace stresu na počátku stacionární fáze, kdy dochází přirozeně k posílení produkce PHB. Rovněž je třeba optimalizovat koncentraci stresového faktoru. Nejvyšších výtěžků bylo dosaženo při aplikaci 0,5% etanolu do kultivačního média v 60. hodině kultivace, kdy došlo ke zvýšení výtěžku PHB o 21 %. Tyto výsledky by mohly být základem nové fermentační strategie zvyšující efektivnost výroby PHB.
|
|
|
Studium chování mikroorganismů pomocí mikrokalorimetrie
Piletskaya, Maryia ; Sedláček, Petr (oponent) ; Krouská, Jitka (vedoucí práce)
Diplomová práce se zabývá studiem chování mikroorganismů pomocí mikrokalorimetrie. Teoretická část práce se zabývá především charakterizací mikroorganismu Rhodospirillum rubrum, zvoleného pro experimentální práci a aplikací mikrokalorimetrie v mikrobiologii. Druhým cílem byl screening růstu bakteriálního kmene R. rubrum za využití různých substrátů, následovaný výběrem nejvhodnějšího substrátu na základě experimentálních výsledků a optimalizace jeho koncentrace a aerace média pro daný mikroorganismus pomocí mikrokalorimetrie. Jako vhodné substráty byly použity hexanoát, malát, acetát a fruktóza. Dalším cílem bylo zpracování dat a diskuze výhod a nevýhod výběru substrátu a aerace média s ohledem na růst bakteriálního kmene. Bylo zjištěno, že nejlepším substrátem pro růst je hexanoát, po čemž následovala optimalizace koncentrace a aerace média. Výsledky mikrokalorimetrického měření byly potvrzeny spektrofotometrickým studováním růstové křivky zkoumané bakterie. Taky byl studován vliv osmotického tlaku na bakterie a závislost jejich přežití na obsahu polyhydroxyalkanoátů (PHA) v buňce. Množství PHA v biomase bylo stanoveno chromatograficky.
|
|
|
Využití vybraných extremofilních bakterií k produkci bioplastů
Vidláková, Michaela ; Obručová,, Hana (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce je zaměřena na studium biotechnologického potenciálu termofilních bakterií Tepidiphilus thermophilus, Tepidimonas taiwanensis a Tepidimonas fonticaldi. Cílem práce bylo prozkoumat schopnost bakterií produkovat polyhydroxyalkanoáty (PHA). V teoretické části je zahrnuta charakteristika PHA a extremofilních bakterií. V experimentální části byly zkoumané bakterie testovány pomocí molekulárně biologické metody PCR na přítomnost genu phaC kódujícího PHA syntázu první třídy. Přítomnost genu phaC byla potvrzena u bakteriálních kmenů Tepidiphilus thermophilus a Tepidimonas taiwanensis. U všech vybraných mikroorganismů byla prověřována schopnost produkce PHA na různých zdrojích uhlíku, byly stanoveny optimální teploty pro kultivaci a přídavkem prekurzorů do produkčního média byla zjišťována schopnost syntézy kopolymerů. Nejintenzivnější produkce PHA byla zaznamenána u bakteriálního kmene Tepidimonas taiwanensis, avšak ostatní kmeny byly také schopny tvořit PHA. U některých kmenů byla prokázána i schopnost produkce kopolymerů P(3HB-co-3HV) nebo P(3HB-co-4HB). Významné množství P(3HB-co-3HV) bylo získáno při použití kmene Tepidimonas taiwanensis. U kmene Tepidimonas taiwanensis byla testována schopnost využití různých modelových hydrolyzátů k tvorbě PHA. K nejvyššímu zisku PHA došlo při použití modelového hydrolyzátu měkkého dřeva. Dále byla testována schopnost tvorby proteáz vybranými kmeny bakterií. Přítomnost těchto enzymů byla zjištěna u kmene Tepidimonas taiwanensis, u kterého následovalo stanovení teplotního optima proteáz, pH optima proteáz a jejich molekulové velikosti.
|
|
|
Studium metabolismu polyhydroxyalkanoátů u bakterie Rhodospirillum rubrum
Rubanová, Blanka ; Vodička, Juraj (oponent) ; Slaninová, Eva (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá studiem metabolismu polyhydroxyalkanoátů (PHA) u bakterie Rhodospirillum rubrum za odlišných podmínek kultivace. Podmínky se lišily v míře aerace (aerobní, anaerobní, mikroaerobní) a v přítomnosti světelného zdroje (světelná kultivace, temnostní kultivace). Nejprve byly navrženy a otestovány různé objemy média pro nejrychlejší a nejvhodnější kultivaci inokula. Následně byly porovnávány kultivace Rhodospirillum rubrum za různých podmínek z hlediska obsahu PHA pomocí plynové chromatografie. Pro lepší charakterizaci růstu a metabolismu bakterií byly kromě plynové chromatografie použity další doplňkové metody, jako například průtoková cytometrie, UV-VIS spektroskopie (transmisní a difúzně transmisní mód). Z hlediska morfologie buněk byla využita fluorescenční mikroskopie a kryo-skenovací elektronová mikroskopie. Dále byla zkoumána schopnost bakterií syntetizovat barevné pigmenty (karotenoidy a bakteriochlorofyl a). Bakterie byly kultivovány na odlišných typech média (tekuté, pevné), barevné pigmenty byly následně extrahovány a byly vypočtena jejich koncentrace. Pro měření barevných pigmentů byla dále použita UV-VIS spektroskopie, Ramanova spektroskopie a infračervená spektroskopie s Fourierovou transformací (FTIR).
|
|
|
Biotechnologické produkce PHA kopolymerů obsahujících 4-hydroxybuytrát
Kovářová, Radka ; Pernicová, Iva (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Cílem předložené diplomové práce je studium biotechnologické produkce kopolymeru poly(3 hydroxybutyrát-co-4-hydroxybutyrát). V první části práce byl proveden výběr vhodného bakteriálního kmenu z pěti vybraných mikroorganismů s různými prekurzory 4HB. Následně proběhla selekce vhodného substrátu a jeho optimální koncentrace. Mikroorganismy využívané v experimentální části byly Cupriavidus malaysiensis DSM 19416, DSM 19379 a DSM 25816, Thermomonas hydrothermalis DSM 14834 a Aneurinibacillus thermoaerophilus H1 CCM 8960. Výběr vhodného kandidáta byl proveden pomocí izolace kopolymeru a jeho následné charakterizace prostřednictvím plynové chromatografie s plamenovým ionizačním detektorem (GC-FID) a SEC-MALS analýzy (vylučovací chromatografie s detektorem měřícím statický rozptyl světla ve více úhlech). Výběr ideálního kandidáta byl posouzen gravimetricky a spektrofotometricky. V rámci experimentální práce bylo důležité zvolit optimální substrát a koncentraci pro akumulaci kopolymeru. Z provedených experimentů vyplývá, že nejvhodnějším kandidátem pro biotechnologickou produkci kopolymeru je bakteriální kmen Cupriavidus malaysiensis DSM 19379 V závěru experimentální práce byla prozkoumána biotechnologická produkce kopolymeru v laboratorním fermentoru.
|
|
|
Isolace, identifikace a charakterizace extremofilů schopných produkce PHA
Vlasáková, Terézia ; Turková, Kristýna (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Predložená diplomová práca sa zameriava na izoláciu a identifikáciu termofilných mikroorganizmov schopných produkcie polyhydroxyalkanoátov (PHA) vo vzorke aktivovaného kalu z čističky odpadových vôd. Z aktivovaného kalu bolo pomocou kultivačných techník a metód molekulárnej biológie vyizolovaných 6 vzoriek, ktoré boli na základe nukleotidových sekvencií génu 16S rRNA bližšie identifikované a zaradené k bakteriálnemu rodu Anoxybacillus. Tieto vzorky obsahovali gén phaC kódujúci PHA syntázu a poskytovali pozitívnu odozvu na detekciu intracelulárnych lipidických štruktúr farbením kolónií Nílskou červeňou. Produkcia PHA s vybranými izolátmi však nebola úspešná. Dôvodom mohlo byť nevyhovujúce produkčné médium či nastavené podmienky produkcie. Pozitívny fenotypový výsledok pri farbení Nílskou červeňou bol zrejme spôsobený produkciou veľkého množstva lipidu poskytujúceho podobnú fluorescenciu ako granule PHA.
|
host ::
RSS.