|
|
The influence of spinal anesthesia on the degree of DNA damage
Koščáková, Mária ; Kuchařová, Monika (vedoucí práce) ; Vokřál, Ivan (oponent)
Cieľ práce: Ľudský organizmus sa denne podrobuje pôsobeniu mnohých endogénnych a exogénnych látok, ktoré sú zdrojom oxidatívneho poškodenia. Pri vysokých koncentráciách a hromadení oxidačného stresu v bunkách dochádza k poškodeniu ich štruktúr vrátane DNA (deoxyribonukleová kyselina) v jadre. Prevaha tohto poškodzujúceho procesu môže byť neskôr zodpovedná za vznik ľudských chorôb ako je rakovina, neurodegeneratívne ochorenia či srdcové zlyhanie. V našej štúdií sme pozorovali oxidatívne poškodenie na úrovni DNA vznikajúce vplyvom spinálnej anestézie. Metódy: Spracovávanie vzoriek prebiehalo metódou kométovej analýzy. Princíp spočíva vo fixovaní buniek (lymfocytov) v agarózovom gély, lýze štruktúr bunky pre uvoľnenie nukleotidov, inkubácií so špecifickými enzýmami a vystavení pôsobeniu elektrického poľa v procese elektroforézy. Poškodené, negatívne nabité časti DNA v elektrickom poli putujú smerom ku kladne nabitej anóde čím vytvárajú typický kométový tvar. Pre vizualizáciu boli gély zafarbené etídiom bromidom (DNA interkalačné farbivo). Výsledky: Kvantifikovali sme jednoreťazcové zlomy, oxidované puríny a pyrimidíny (použitie enzýmov pre detekciu špecifických lézií). Výsledky sú udávané v percentách DNA vo chvoste kométy. Princípom je porovnanie intenzity chvosta kométy s celkovou intenzitou kométy....
|
|
|
The influence of anesthesia on the degree of DNA oxidative damage
Zubáňová, Veronika ; Kuchařová, Monika (vedoucí práce) ; Nováková, Veronika (oponent)
Cieľ práce: Oxidatívne poškodenie je jedným z najčastejších typov poškodenia bunkových komponent, ktorý vedie k oxidácii lipidov, proteínov ale aj molekúl DNA (deoxyribonukleová kyselina). V dôsledku toho dochádza k vyššiemu výskytu rôznych patológií ako sú ateroskleróza, neurodegeneratívne ochorenia, rakovina alebo diabetes. V našej štúdii sme sa zamerali na vplyv celkovej anestézie na poškodenie DNA počas menšej operácie s použitím techniky kométovej analýzy. Metódy: Základným princípom tejto metódy je fixácia buniek (lymfocytov) v agaróze, ich lýza pre odstránenie membrán, inkubácia so špecifickými enzýmami a elektroforéza uvoľnených bunkových jadier. Počas elektroforézy sa voľné nízkomolekulárne a negatívne nabité fragmenty DNA pohybujú smerom k anóde, čo spôsobuje tvorbu typického kométového tvaru bunky. Na konci boli gély nafarbené etídiom bromidu (DNA interkalačná farbička) a vizualizované. Výsledky: Skúmali sme jednoreťazcové zlomy a, s použitím modifikovanej metódy s využitím špecifických enzýmov na detekciu špecifických lézií, tiež oxidované puríny a pyrimidíny. Navýšenie DNA poškodenia, určené intenzitou chvosta kométy, bolo kvantifikované použitím LUCIA Comet Assay (Laboratory Imaging, Czech Republic) softvéu pre obrazovú analýzu. Záver: Výsledky boli použité na porovnanie poškodenia...
|
|
| |
|
|
Biotechnologické využití rostlinných virů
Vaculík, Petr ; Čeřovská, Noemi (vedoucí práce) ; Ryšánek, Pavel (oponent) ; Petrzik, Karel (oponent)
Model terciární struktury kapsidového proteinu X viru bramboru (PVX CP) byl využit jako předloha pro navržení nových pozic pro vkládání antigenů za účelem jejich prezentace na povrchu částic PVX. Na základě tohoto modelu bylo vybráno sedm pozic (A-G), které se nacházejí na povrchu virionu. Jako antigen pro prezentaci byl použit 17 aminokyselinový epitop onkoproteinu E7 odvozený od lidského papilomaviru typu 16 (E7 epitop) ve fúzi s 6xHis kotvou nebo StrepII kotvou, a to v obou možných uspořádáních (6xHis-E7, E7-6xHis, StrepII-E7 a E7-StrepII). Modifikované PVX CP byly nejprve exprimovány v Escherichia coli MC1061, kde docházelo k tvorbě virových částic pouze v případě vložení inzertů StrepII-E7 a E7-StrepII do pozice A v PVX CP. Výsledky z transientní exprese modifikovaných PVX CP v Nicotiana benthamiana prokázaly, že nejvhodnější pozice pro prezentaci antigenů je pozice A, která je situovaná mezi 24. a 25. aminokyselinou v PVX CP. Dále bylo zjištěno, že virové částice mohly být detekovány pouze v přítomnosti StrepII kotvy a že stabilita těchto částic je ovlivněna uspořádáním inzertu (StrepII-E7 vs. E7-StrepII), neboť bylo možné purifikovat pouze virové částice nesoucí inzert v uspořádání E7-StrepII. Kromě využití PVX pro přípravu antigen prezentujícího systému byl také posouzen vliv infekce PVX na...
|
|
|
Biotechnologické využití rostlinných virů
Vaculík, Petr
Model terciární struktury kapsidového proteinu X viru bramboru (PVX CP) byl využit jako předloha pro navržení nových pozic pro vkládání antigenů za účelem jejich prezentace na povrchu částic PVX. Na základě tohoto modelu bylo vybráno sedm pozic (A-G), které se nacházejí na povrchu virionu. Jako antigen pro prezentaci byl použit 17 aminokyselinový epitop onkoproteinu E7 odvozený od lidského papilomaviru typu 16 (E7 epitop) ve fúzi s 6xHis kotvou nebo StrepII kotvou, a to v obou možných uspořádáních (6xHis-E7, E7-6xHis, StrepII-E7 a E7-StrepII). Modifikované PVX CP byly nejprve exprimovány v Escherichia coli MC1061, kde docházelo k tvorbě virových částic pouze v případě vložení inzertů StrepII-E7 a E7-StrepII do pozice A v PVX CP. Výsledky z transientní exprese modifikovaných PVX CP v Nicotiana benthamiana prokázaly, že nejvhodnější pozice pro prezentaci antigenů je pozice A, která je situovaná mezi 24. a 25. aminokyselinou v PVX CP. Dále bylo zjištěno, že virové částice mohly být detekovány pouze v přítomnosti StrepII kotvy a že stabilita těchto částic je ovlivněna uspořádáním inzertu (StrepII-E7 vs. E7-StrepII), neboť bylo možné purifikovat pouze virové částice nesoucí inzert v uspořádání E7-StrepII. Kromě využití PVX pro přípravu antigen prezentujícího systému byl také posouzen vliv infekce PVX na...
|
|
|
Oxidační poškození buněčných komponent po indukci oxidačního stresu specifickými herbicidy
Kramná, Barbara ; Wilhelmová, Naďa (vedoucí práce) ; Ryšlavá, Helena (oponent)
1. Abstrakt Oxidační stres je způsoben nadměrnou produkcí a akumulací ROS (reaktivních forem kyslíku) a je častým důvodem buněčného poškození za nepříznivých environmentálních podmínek, např. za sucha, chladu, zasolení. Ve své práci jsem využila specifického působení herbicidů MV (methyl viologen) a 3-AT (3-aminotriazol) k přímé indukci oxidačního stresu u rostlin tabáku (Nicotiana tabacum cv. Xanthi). Míra oxidačního poškození byla sledována na úrovni DNA pomocí kometového testu, dále na peroxidaci lipidů, hladině karbonylovaných proteinů a modifikaci aktivit antioxidačních enzymů CAT (katalázy) a APX (askorbátperoxidázy). Konfokální fluorescenční mikroskopie zdokumentovala změnu redoxního stavu buněk po aplikaci herbicidů a při vyšších koncentracích byl pozorovaný signál specificky lokalizován do peroxizómů. Použité herbicidy působily v řádově odlišných koncentracích, MV v µM a 3-AT v mM a oba způsobily výrazné poškození jaderné DNA. Jako další průkazný marker oxidačního stresu po aplikaci MV se ukázala být karbonylace proteinů. Inhibice antioxidačních enzymů CAT a APX byla oproti 3-AT méně výrazná. Klesající stabilita membrán se ukázala být univerzálním markerem oxidačního poškození pro oba herbicidy, zatímco peroxidace lipidů byla neprůkazná. MV a 3-AT mají rozdílné módy účinku, a každý působí na...
|
|
|
Optimalizace chromozómových manipulací u jeseterovitých ryb
LEBEDA, Ievgen
Vysoce výnosný trh s černým kaviárem a decimování divoce žijících populací jeseterů v následku vedou ke zdokonalování akvakultury těchto druhů. Chromozomové manipulace, a v jejich rámci obzvláště gynogeneze se nachází v centru pozornosti jako způsob, jak změnit poměr samic a samců v potomstvu. Tato studie byla zaměřena na optimalizaci chromozomových manipulací u jeseterů, a to především na gynogenezi. Byly analyzovány důvody nízké míry přežití a optimalizovány zásadní kroky k indukci gynogeneze. Dále byly prozkoumány alternativní způsoby inaktivace DNA spermatu, stejně jako vliv přirozených mechanismů reparace DNA závislých na světle na výsledky indukce gynogeneze. Byly navrženy metody využití mezidruhové gynogeneze pro zjednodušení separace gynogenetického potomstva. Spektrofotometrický výzkum byl použit ke zjištění schopnosti UV světla, jako nejběžnějšího prostředku inaktivace DNA, k proniknutí do vzorku spermatu. Dále, výzkum motility ozářených spermií a výsledky parciální indukce gynogeneze ukázaly, že nízká transparentnost spermií pro UV světlo může způsobit významnou heterogenitu UV ozáření. V důsledku toho bylo navrženo vhodné naředění spermií, jako zásadní krok pro homogenní UV ozáření vzorku. Gynogeneze jesetera malého byla indukována použitím chemických látek, které poškozují DNA spermií jako alternativa k UV ozařování pro účely hromadné produkce gynogenů. Všechny testované substance ukázaly schopnost inaktivovat DNA spermií a produkovat gynogeny. Nicméně byl pozorován negativní dopad ošetření chemickými látkami na motilitu spermií. Následně tyto typy ošetření měly nízkou účinnost indukce gynogeneze. Nejvyšší procento produkovaných gynogenetických larev 19,8 ? 8,9 % bylo získáno při ošetření spermatu aminomethyl-4,5',8-trimethylpsoralenem v koncentraci 50 ?M, následovaném ozářením UV - A (360 nm) o dávce 900 J/m2. Tento typ ošetření by mohl být využíván jako náhrada běžně používaného UV-C záření, například při ošetření velkého objemu spermatu. Podrobný výzkum fotoreaktivace spermií jeseterů odhalil významnou míru na světle závislé reparace DNA spermií ozářených vysokými dávkami UV-C světla. Indukce gynogeneze s použitím spermií ozářených UV-C zářením a vystavených viditelnému světlu měla za následek významné odchylky od typického Hertwigova efektu. Naproti tomu, červené světlo s vlnovou délkou větší než 600 nm nevedlo ke snížení poškození DNA, místo toho byl nalezen mírný nárůst poškození DNA, tzv. že se neindukovala fotoreaktivace. Proto bylo během indukce gynogeneze navrženo použití infračerveného světla k osvětlení pracovních míst. Použití mezidruhové gynogeneze, a to zejména využití gamet jeseterovitých druhů s různou úrovní ploidie bylo navrženo jako způsob jak zjednodušit separaci gynogenů. Kromě toho aplikace této metody umožňuje odděleně zkoumat efektivnost DNA inaktivace a obnovu ploidní úrovně stejně jako při posouzení fitness parametrů a přežití v každé skupině potomstva bez fyzické separace ryb. Rovněž byla provedena optimalizace protokolu tetraploidizace jesetera malého pro budoucí uplatnění tetraploidních jedinců s diploidními jikrami a spermiemi při indukci gynogeneze a androgeneze. Závěrem lze konstatovat, že popsané metody a protokoly dovolují indukovat gynogenezi u jeseterů s dostatečnou mírou přežití pro akvakulturu, s přihlédnutím k jejich vysoké plodnosti, i když je potřeba pokračovat v provádění dalších studií o dalších dopadech tohoto zásahu na rybí organismus.
|
host ::
RSS.