|
|
Nestrukturní proteiny virů Zika a Dengue s enzymovou aktivitou.
Krýsová, Eliška ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Novotný, Marian (oponent)
Viry Zika a Dengue kódují vlastní enzymy, které jsou aktivní v různých stádiích replikačního cyklu. NS3, NS5 protein a jejich kofaktory hrají nepostradatelnou roli ve fungování flavivirů. I když byly struktury těchto proteinů již vyřešeny, jejich vlastnosti jsou prozkoumány jen částečně a mnoho aspektů ohledně jejich funkce zůstává nevyřešeno. Hlavními tématy této práce je úloha NS3 a NS5 proteinu v životním cyklu virů Zika a Dengue, sestřih polyproteinového prekurzoru, samotná replikace a interakce těchto enzymů s dalšími strukturními a nestrukturními proteiny. NS3 a NS5 protein mají mnoho enzymatických aktivit strukturně i funkčně oddělených, což je činí zajímavými z hlediska výzkumu autoaktivace, interakce funkčních domén a proteinů mezi sebou. Jelikož jsou infekce viry Zika a Dengue stále velmi vážným problémem, je nezbytné co nejlépe pochopit molekulární mechanismy jejich replikace. Klíčová slova: proteasa, polymerasa, Zika, Dengue, sestřih polyproteinů, protivirová terapie
|
|
|
Regulace aktivity katepsinu K pomocí reaktivních inhibičních molekul využitelných v biomedicíně
Benýšek, Jakub ; Mareš, Michael (vedoucí práce) ; Obšilová, Veronika (oponent) ; Kutil, Zsófia (oponent)
2 Abstrakt Lidský katepsin K (KatK) je lysozomální cysteinová proteasa exprimovaná především v osteoklastech. Fyziologická funkce spočívá v degradaci extracelulární kostní matrix, kde je nejúčinnějším enzymem pro štěpení kolagenu. Zvýšená enzymatická aktivita KatK je spojena s osteoporózou a dále revmatoidní artritidou a osteoartritidou. Proto je KatK cílovou molekulou pro léčbu uvedených patologií a k jeho regulaci jsou vyvíjena chemoterapeutika na bázi proteasových inhibitorů. Tato práce se zabývá reaktivními peptidomimetickými a nízkomolekulárními inhibitory KatK typu thiadiazolů, vinylketonů a cyanohydrazidů. Soustředí se zejména na určení vazebného módu selektivních inhibitorů a charakterizaci jejich interakcí s aktivním místem KatK. Přístupy rentgenostrukturní analýzy jsou kombinovány s výpočetní chemií, enzymologickou analýzou a buněčnými testy k objasnění vztahu mezi strukturou a biochemickou aktivitou těchto inhibitorů. Získané výsledky přinášejí významné informace pro navrhování a optimalizaci nových vysoce účinných a selektivních inhibitorů KatK určených pro vývoj potenciálních léčiv a diagnostických sond. Klíčová slova: katepsin K, proteasa, inhibitor, 3D struktura, osteoporóza
|
|
|
Proteolytické enzymy krevničky střevní (Schistosoma mansoni): patobiochemie a využití v biomedicíně
Leontovyč, Adrian ; Mareš, Michael (vedoucí práce) ; Kašný, Martin (oponent) ; Mikeš, Libor (oponent)
Krevní motolice rodu Schistosoma způsobují závažné parazitární onemocnění schistosomózu, které postihuje celosvětově přes 250 milionů lidí a představuje spolu s malárii nejvýznamnější parazitózy. Vzhledem k nebezpečí vzniku rezistence k jedinému používanému léku jsou intenzivně hledány nové způsoby terapie schistosomózy. Proteolytické enzymy krevniček jsou klíčové pro jejich přežití v hostiteli, a proto jsou slibnými cílovými molekulami pro vývoj nových chemoterapeutik a vakcín. Tato práce se zabývá dvěma proteasami z krevničky střevní (Schistosoma mansoni), které byly připraveny jako rekombinantní proteiny a komplexně funkčně charakterizovány. První z nich je serinová proteasa SmSP2, která je lokalizovaná na povrchu dospělců a sekretovaná do krve hostitele. Byla identifikována jako vasodilatační a fibrinolytický faktor a navržena její modulační role při interakci parazita s hostitelem. Druhou zkoumanou proteasou je cysteinový katepsin SmCL3, který se účastní trávení hostitelských krevních proteinů sloužících krevničkám jako zdroj živin. Byly identifikovány účinné peptidomimetické inhibitory SmCL3, u nichž byla prokázána antischistosomální aktivita v testech s živými parazity. Disertační práce přináší nové významné poznatky o proteasách krevničky S. mansoni, jejich patobiochemii a inhibiční...
|
|
|
Inhibitory Kunitzova typu u Eudiplozoon nipponicum
Černíková, Markéta ; Mikeš, Libor (vedoucí práce) ; Jedličková, Lucie (oponent)
Proteiny obsahující Kunitz domény jsou nejčastěji inhibitory serinových proteáz. Jejich obecnou charakteristikou je přítomnost tří disulfidových vazeb a relativně malá velikost kolem 6-10 kDa, ale nezřídka se objevují velké proteiny s několika Kunitz doménami nebo jsou tyto domény součástí komplexnějších proteinů. Jejich funkce obvykle souvisí s regulací fyziologických a proteolytických procesů, ale i s interakcí s patogeny nebo jinými obrannými mechanismy, např. jako součást hlenu sasanek nebo jedu hadů a jiných bezobratlých živočichů. Zaměřili jsme se na Kunitz proteiny u Eudiplozoon nipponicum, parazita třídy Monogenea ze žaber kapra obecného (Cyprinus carpio). V transkriptomu tohoto parazita bylo identifikováno na základě podobnosti s již popsaným Kunitz proteinem EnKT1 několik dalších podobných sekvencí, z čehož lze usuzovat, že tento parazit využívá pro svou specifickou potravní strategii, podobně jako i jiní krevsající paraziti, celou sadu inhibitorů serinových proteáz s různými konkrétními funkcemi. Pomocí PCR bylo několik sekvencí s Kunitz doménou nalezených v transkriptomu ověřováno a případně doplněno pomocí RACE-PCR. Jeden protein, nazvaný EnKC1, byl následně produkován rekombinantně expresí v buňkách bakterie E. coli kmenů SHuffleTM a Rosetta Gami B. U rekombinantního proteinu s Kunitz...
|
|
|
Generation and analysis of mutant mouse model to study roles of KLKs in cutaneous inflammation
Eliáš, Jan ; Kašpárek, Petr (vedoucí práce) ; Drbal, Karel (oponent)
Kallikreinové peptidázy (KLKs) jsou podskupinou serinových proteáz se zásadní důležitostí pro řadu funkcí, jejichž dysregulace přispívá k řadě patologických fenotypů. Nethertonův syndrom zaujímá mezi těmito patologiemi zásadní postavení, jelikož deregulace kallikreinových proteáz hraje klíčovou roli, především KLK5, KLK7 a do menší miry také KLK14. V případě této patologie je narušen gen hlavního regulačního proteinu těchto proteáz v kůži, kterým je SPINK5. To vede k nekontrolované hyprreaktivitě těchto proteáz a následnému narušení epidermální bariéry díky nadměrné epidermální deskvamaci a vážnému zánětu kůže. Zánětlivé mechanismy Nethertonova syndromu jsou v tuto chvíli relativně málo objasněné a panuje přesvědčení, že hlavní roli hraje zpracování imunitních molekul pomocí těchto proteáz a dysregulace kožního mikrobiomu. TNFα signalizace hraje klíčovou roli v imunitní odpovědi proti mikrobům a chronické kožní záněty mohou vest k závažným zdravotním stavům, ve kterých je TNFα důležitým komponentem. Abychom adresovali vliv TNFα signalizace v kontextu kallikreinových proteáz a Nethertonova syndromu, tak jsme vytvořili myší model, ve kterém je narušen gen Tnfr1 kódující protein receptor TNFR1 na pozadí již vytvořených modelů Nethertonova syndromu. Úspěšně jsme vytvořili Tnfr1-/- myší model a následně...
|
|
|
Bioaktivní molekuly zapojené do zpracování krve u hematofágních monogeneí čeledi Diplozoidae
Jedličková, Lucie
Monogenea z čeledi Diplozoidae (podtřída Heteronchoinea) jsou krevsající ektoparaziti nacházející se na žábrách kaprovitých ryb. Trávení krve u diplozoidů probíhá intracelulárně v lysozomálním cyklu buněk gastrodermis střeva za přítomnosti peptidáz parazita. Avšak informace o způsobu trávení krve u této skupiny pocházely dosud pouze z ultrastrukturálních a histochemických analýz. Proto jsem se v této práci zaměřila na biochemickou a molekulární charakteristiku vybraných bioaktivních molekul, které by se mohly podílet na zpracování krve dospělci Eudiplozoon nipponicum, a to konkrétně na cysteinové peptidázy typu katepsinů L a B, aspartické peptidázy typu katepsinu D a na inhibitory serinových peptidáz Kunitzova typu. V homogenátech a exkrečně/sekrečních (E/S) produktech dospělců E. nipponicum dominovala aktivita cysteinových peptidáz typu katepsinu L, následovaná aktivitou aspartických peptidáz typu katepsinu D a minoritním podílem aktivity katepsinů B. Hemoglobinolytická aktivita těchto vzorků byla kompletně zablokována inhibitory jmenovaných typů peptidáz. V transkriptomu dospělců E. nipponicum byly objeveny transkripty kódující 10 katepsinů L a pouze 1 katepsin B. Primární struktury kódovaných enzymů byly bioinformaticky a fylogeneticky porovnány. Dva abundantní katepsiny L (EnCL1, EnCL3) byly...
|
|
|
BIOPHYSICAL AND FUNCTIONAL CHARACTERIZATION OF DDI1-LIKE ASPARTIC PROTEASES INVOLVED IN REPLICATION STRESS RESPONSE
Svoboda, Michal ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Čermák, Lukáš (oponent)
Bezchybná a včasná replikace molekul DNA je jedním z rozhodujících momentů životního cyklu každého organismu. Jakýkoliv defekt, ať už v časování či lokalizaci, může tento delikátní, na přesnosti závislý mechanismus uvrhnout do stavu takzvaného replikačního stresu. Některé z překážek blokujících postup replikační vidličky obsahují proteinovou složku. V průběhu evoluce se tak vyvinuly specializované proteasy, zodpovědné právě za uvolňování replikačního stresu. Kompletní paleta těchto proteolytických enzymů, stejně jako jejich substrátový repertoár a detailní molekulární mechanismus jejich zapojení v obraně proti DNA replikačnímu stresu však dosud nebyly objasněny. Tato disertační práce se zabývá rolí evolučně konzervovaných aspartátových proteas z rodiny proteinů podobných Ddi1 v proteolytické odpovědi na DNA replikační stres. V této práci byly strukturně a biofyzikálně charakterisováni členové rodiny Ddi1 podobných proteinů kvasinkového a lidského původu, byly prozkoumány jejich interakce s ubikvitinem, stejně jako s polyubikvitinovými řetězci. V neposlední řadě byla též mutantního kvasinkového kmene, který vedle genu pro DDI1 postrádá také gen pro DNA aktivovanou metalloproteasu WSS1, identifikována přecitlivělost na hydroxymočovinu, známý inhibitor replikace DNA. Detailní rozbor role kvasinkové...
|
|
|
Bioaktivní molekuly zapojené do zpracování krve u hematofágních monogeneí čeledi Diplozoidae
Jedličková, Lucie
Monogenea z čeledi Diplozoidae (podtřída Heteronchoinea) jsou krevsající ektoparaziti nacházející se na žábrách kaprovitých ryb. Trávení krve u diplozoidů probíhá intracelulárně v lysozomálním cyklu buněk gastrodermis střeva za přítomnosti peptidáz parazita. Avšak informace o způsobu trávení krve u této skupiny pocházely dosud pouze z ultrastrukturálních a histochemických analýz. Proto jsem se v této práci zaměřila na biochemickou a molekulární charakteristiku vybraných bioaktivních molekul, které by se mohly podílet na zpracování krve dospělci Eudiplozoon nipponicum, a to konkrétně na cysteinové peptidázy typu katepsinů L a B, aspartické peptidázy typu katepsinu D a na inhibitory serinových peptidáz Kunitzova typu. V homogenátech a exkrečně/sekrečních (E/S) produktech dospělců E. nipponicum dominovala aktivita cysteinových peptidáz typu katepsinu L, následovaná aktivitou aspartických peptidáz typu katepsinu D a minoritním podílem aktivity katepsinů B. Hemoglobinolytická aktivita těchto vzorků byla kompletně zablokována inhibitory jmenovaných typů peptidáz. V transkriptomu dospělců E. nipponicum byly objeveny transkripty kódující 10 katepsinů L a pouze 1 katepsin B. Primární struktury kódovaných enzymů byly bioinformaticky a fylogeneticky porovnány. Dva abundantní katepsiny L (EnCL1, EnCL3) byly...
|
|
|
Bioaktivní molekuly zapojené do zpracování krve u hematofágních monogeneí čeledi Diplozoidae
Jedličková, Lucie ; Mikeš, Libor (vedoucí práce) ; Horn, Martin (oponent) ; Sojka, Daniel (oponent)
Monogenea z čeledi Diplozoidae (podtřída Heteronchoinea) jsou krevsající ektoparaziti nacházející se na žábrách kaprovitých ryb. Trávení krve u diplozoidů probíhá intracelulárně v lysozomálním cyklu buněk gastrodermis střeva za přítomnosti peptidáz parazita. Avšak informace o způsobu trávení krve u této skupiny pocházely dosud pouze z ultrastrukturálních a histochemických analýz. Proto jsem se v této práci zaměřila na biochemickou a molekulární charakteristiku vybraných bioaktivních molekul, které by se mohly podílet na zpracování krve dospělci Eudiplozoon nipponicum, a to konkrétně na cysteinové peptidázy typu katepsinů L a B, aspartické peptidázy typu katepsinu D a na inhibitory serinových peptidáz Kunitzova typu. V homogenátech a exkrečně/sekrečních (E/S) produktech dospělců E. nipponicum dominovala aktivita cysteinových peptidáz typu katepsinu L, následovaná aktivitou aspartických peptidáz typu katepsinu D a minoritním podílem aktivity katepsinů B. Hemoglobinolytická aktivita těchto vzorků byla kompletně zablokována inhibitory jmenovaných typů peptidáz. V transkriptomu dospělců E. nipponicum byly objeveny transkripty kódující 10 katepsinů L a pouze 1 katepsin B. Primární struktury kódovaných enzymů byly bioinformaticky a fylogeneticky porovnány. Dva abundantní katepsiny L (EnCL1, EnCL3) byly...
|
|
|
Study of the substrate specificity of the LACTB tumour suppressor enzyme
Baudyšová, Alžběta ; Kečkéšová, Zuzana (vedoucí práce) ; Janečková, Lucie (oponent)
Mitochondriální beta-laktamasa (LACTB) je nádorový supresor, jehož exprese způsobuje změny v metabolismu mitochondriálních fosfolipidů a indukuje diferenciaci nádorových buněk v buňky nerakovinné. Tento jev je způsoben down regulací fosfatidylserin dekaboxylasy (PISD), což následně vede ke snížení množství fosfatidyletanolaminů a lysofosfatidyletanolaminů v membráně mitochondrie. PISD ale není LACTB přímo štěpeno a tedy otázka, co je fyziologickým substrátem LACTB, zůstává stále nezodpovězená. Abychom se pokusili zaplnit tuto mezeru v našem poznání o mechanismech a funkci nádorového supresoru LACTB, byla tato diplomová práce zaměřena na nalezení substrátu LACTB pomocí proteomické analýzy PICS. Aby mohla být analýza provedena, bylo třeba nejprve vyizolovat rekombinantní wild-type LACTB a také LACTB se zrušeným katalytickým místem, zjistit, jaké je ideální in vitro prostředí pro práci s rekombinantním LACTB a také jaké podmínky jsou nutné pro to, aby LACTB tvořila multimery. Mé výsledky ukázaly, že aktivita LACTB in vitro stoupá se zvyšujícím se pH a také po přidání vápníku. Také jsem ukázala, že monomery LACTB v multimerních formách jsou spojeny disulfidickými můstky a že se tyto multimery rozpadají po přidání dithiothreitolu. Nejzajímavějším výsledkem práce byl poznatek, že LACTB je svým vlastním...
|
host ::
RSS.