|
|
Příprava delečních mutantů lidského cytochromu b5 pomocí genové syntézy
Kotlánová, Iveta ; Martínek, Václav (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
Cytochrom b5 je malý amfipatický protein. Jeho lidská forma se nachází ukotvena ve vnější membráně endoplazmatického retikula a mitochondrií, volně se nachází v červených krvinkách. Skládá se ze dvou domén: Větší hydrofilní doména váže hem, menší hydrofobní doména ukotvuje cytochrom b5 v mikrosomální membráně. Obě domény jsou spojeny linkerem, což je řetězec asi 15 aminokyselin, který dodává proteinu potřebnou flexibilitu. Jeho délka hraje významnou roli při přenášení elektronů na cytochrom P450. Pokud je linkerová doména příliš krátká, cytochrom b5 nedokáže přenášet elektrony na cytochrom P450 a neúčastní se tak reakcí MFO systému. Ostatní funkce jsou však zachovány. Cílem této práce bylo navrhnout a pomocí genové syntézy vytvořit 4 deleční mutanty cytochromu b5. Jejich linkerová doména obsahovala krátké i dlouhé delece, u kterých se předpokládá narušení interakce s cytochromem P450. Součástí práce byla heterologní exprese proteinů pomocí buněk Escherichia coli kmenů XL10-Gold a DH5α. Jako expresní vektory pro transformaci byly použity plasmidy pET-30a(+) a pET-22b. DNA byla z buněk izolována a sekvenací byla ověřena správnost genetického kódu. Klíčová slova: cytochrom b5, heterologní exprese, genová syntéza
|
|
|
Heterologní exprese NADPH:cytochrom P450 reduktasy
Stráňava, Martin ; Černá, Věra (vedoucí práce) ; Martínek, Václav (oponent)
NADPH:cytochrom P450 reduktasa (CPR) je flavoprotein o velikosti 78 kDa, který je spolu s cytochromy P450 součástí monooxygenasového systému vázaného v membráně endoplasmatického retikula. Monooxygenasový systém se účastní metabolizmu široké škály organických látek, včetně léčiv nebo různých polutantů přítomných v životním prostředí (polycyklické aromatické uhlovodíky, aromatické aminy aj.). CPR funguje jako přenašeč redukčních ekvivalentů z NADPH na příslušné cytochromy P450. Pro správnou interakci s cytochromy P450 je důležitá N-terminální hydrofobní doména kotvící protein v membráně. Odstranění této domény, např. trypsinovou proteolýzou, má za následek vznik solubilní CPR (72 kDa) a ztrátu katalytické aktivity vůči cytochromu P450. V průběhu heterologní exprese v bakteriích E. coli je proteolyticky labilní místo CPR (Lys56 - Ile57) cílem působení intracelulárních proteas s trypsinovou aktivitou, což může negativně ovlivnit výtěžky nativního 78 kDa proteinu. Předkládaná diplomová práce popisuje heterologní expresi, purifikaci a charakterizaci dvou forem potkaní CPR. Forma wtCPR představuje protein přirozeně se vyskytující v potkaním organismu (kmen Wistar), zatímco mCPR obsahuje aminokyselinovou substituci (K56Q) v místě proteolytické degradace. Výsledkem zmíněné substituce je proteolyticky...
|
|
|
Cílená mutageneze ve studiu lidských cytochromů P450 rodiny 1 a jejich interakčních partnerů
Milichovský, Jan
Cytochromy P450 jsou rozsáhlou skupinou proteinů metabolizujících široké množství substrátů. Řada z nich se významně podílí na metabolismu léčiv či jiných xenobiotik včetně řady chemických karcinogenů. Hemoprotein cytochrom b5 je jedno-elektronový přenašeč elektronů spolupracující s NADPH:cytochrom P450 reduktasou a NADH:cytochrom b5reduktasou 3, který je spjatý s metabolismem zprostředkovaným cytochromy P450. Cytochrom b5 je schopen prostřednictvím modulace aktivity cytochromů P450 ovlivňovat metabolismus řady látek. Cílem disertační práce bylo využít místně cílenou mutagenezi cytochromů P450 rodiny 1 k lepšímu porozumění mechanismu jejich nitroreduktasové aktivity. Dále byla studována interakce cytochromu b5 s cytochromy P450 podrodiny 1A pomocí místně cílené mutageneze jejich předpokládaného kontaktního rozhraní. V rámci práce byly také, za použití kombinace experimentu a teoretických přístupů, studovány rozdíly v redukci lidských cytochromů P450 v intaktních bakteriálních buňkách během jejich heterologní exprese. Z výsledků vyplývá, že nitroreduktasová aktivita CYP1A1, CYP1A2 a CYP1B1 je zprostředkována hydroxylovou skupinou v aktivním místě a jejím zavedením lze u CYP1B1 artificiálně vyvolat nitroreduktasovou aktivitu. Pomocí mutageneze byly také identifikovány aminokyseliny, které se...
|
|
|
Mechanismus působení protinádorového léčiva ellipticinu v cílových tkáních jeho účinku
Mrízová, Iveta
Ellipticin je alkaloid čeledě Apocynaceae, který vykazuje významný protinádorový a anti-HIV účinek. Na metabolismu ellipticinu se podílí cytochromy P450 (CYP) a peroxidasy za vzniku aktivačních a detoxifikačních metabolitů. Již v dřívějších pracích byly identifikovány jednotlivé isoformy CYP, které se podílí na oxidaci ellipticinu v různých tkáních (játra, plíce, ledviny) laboratorního potkana, vhodného modelu ilustrujícího osud ellipticinu v lidském organismu. V této diplomové práce byl studován vliv ellipticinu na obsah a aktivitu cytochromů P450 a na dalších složek MFO systému v tomto zvířecím modelu. Pro stanovení obsahu CYP a dalších složek MFO systému v isolovaných mikrosomech byly využity spektroskopické a elektrochemické metody. Pro stanovení katalytické aktivity CYP a NADPH:cytochrom P450 reduktasy byly využity reakce se specifickými substráty. Z výsledků vyplývá, že u zvířat premedikovaných ellipticinem dochází k zvýšení exprese i katalytické aktivity CYP podrodiny 1A ve všech testovaných orgánech (játra, ledviny, plíce). V játrech navíc dochází vlivem ellipticinu ke zvýšení exprese cytochromu b5 a zvýšení exprese a katalytické aktivity CYP3A. Podobně se i obsah a katalytická aktivita NADPH:cytochrom P450 reduktasy měnila v závislosti na premedikaci zvířat ellipticinem. Cytochrom P450 2S1...
|
|
|
Mutantní glykosidasy s vysokou substrátovou specifitou a jejich analýza
Nekvasilová, Pavlína ; Bojarová, Pavla (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent)
β-N-Acetylhexosaminidasy (EC 3.2.1.52, GH20) jsou retenující exo-glykosidasy, které in vivo odštěpují jak β-N-acetylglukosamin (GlcNAc), tak β-N-acetylgalaktosamin (GalNAc) z glykosylovaných struktur. Za vhodných reakčních podmínek jsou tyto enzymy schopné glykosidovou vazbu i syntetizovat. Cílenou mutagenezí v aktivním centru enzymu lze např. dosáhnout změny substrátové specifity nebo potlačit hydrolytickou aktivitu enzymu ve prospěch syntézy. Předkládaná práce se zabývá třemi mutantními β-N-acetylhexosaminidasami z Talaromyces flavus. V jejich aktivním centru byla provedena záměna aminokyselinových zbytků, které jsou zodpovědné za vazbu hydroxylu na C-4 substrátu (Arg218, Glu546), za aminokyseliny navržené na základě molekulárního modelování. Byl studován vliv vnesených jednobodových mutací na substrátovou specifitu připravených enzymů. Mutantní β-N-acetylhexosaminidasy byly heterologně exprimovány v Pichia pastoris a charakterizovány. Dále byly provedeny transglykosylační reakce s těmito enzymy. Připravené sacharidové produkty byly charakterizovány pomocí NMR.
|
|
|
Cílená mutageneze ve studiu lidských cytochromů P450 rodiny 1 a jejich interakčních partnerů
Milichovský, Jan
Cytochromy P450 jsou rozsáhlou skupinou proteinů metabolizujících široké množství substrátů. Řada z nich se významně podílí na metabolismu léčiv či jiných xenobiotik včetně řady chemických karcinogenů. Hemoprotein cytochrom b5 je jedno-elektronový přenašeč elektronů spolupracující s NADPH:cytochrom P450 reduktasou a NADH:cytochrom b5reduktasou 3, který je spjatý s metabolismem zprostředkovaným cytochromy P450. Cytochrom b5 je schopen prostřednictvím modulace aktivity cytochromů P450 ovlivňovat metabolismus řady látek. Cílem disertační práce bylo využít místně cílenou mutagenezi cytochromů P450 rodiny 1 k lepšímu porozumění mechanismu jejich nitroreduktasové aktivity. Dále byla studována interakce cytochromu b5 s cytochromy P450 podrodiny 1A pomocí místně cílené mutageneze jejich předpokládaného kontaktního rozhraní. V rámci práce byly také, za použití kombinace experimentu a teoretických přístupů, studovány rozdíly v redukci lidských cytochromů P450 v intaktních bakteriálních buňkách během jejich heterologní exprese. Z výsledků vyplývá, že nitroreduktasová aktivita CYP1A1, CYP1A2 a CYP1B1 je zprostředkována hydroxylovou skupinou v aktivním místě a jejím zavedením lze u CYP1B1 artificiálně vyvolat nitroreduktasovou aktivitu. Pomocí mutageneze byly také identifikovány aminokyseliny, které se...
|
|
|
Site-directed mutagenesis of human cytochromes P450 family 1 and their interacting partners
Milichovský, Jan ; Martínek, Václav (vedoucí práce) ; Befekadu, Asfaw (oponent) ; Souček, Pavel (oponent)
Cytochromy P450 jsou rozsáhlou skupinou proteinů metabolizujících široké množství substrátů. Řada z nich se významně podílí na metabolismu léčiv či jiných xenobiotik včetně řady chemických karcinogenů. Hemoprotein cytochrom b5 je jedno-elektronový přenašeč elektronů spolupracující s NADPH:cytochrom P450 reduktasou a NADH:cytochrom b5 reduktasou 3, který je spjatý s metabolismem zprostředkovaným cytochromy P450. Cytochrom b5 je schopen prostřednictvím modulace aktivity cytochromů P450 ovlivňovat metabolismus řady látek. Cílem disertační práce bylo využít místně cílenou mutagenezi cytochromů P450 rodiny 1 k lepšímu porozumění mechanismu jejich nitroreduktasové aktivity. Dále byla studována interakce cytochromu b5 s cytochromy P450 podrodiny 1A pomocí místně cílené mutageneze jejich předpokládaného kontaktního rozhraní. V rámci práce byly také, za použití kombinace experimentu a teoretických přístupů, studovány rozdíly v redukci lidských cytochromů P450 v intaktních bakteriálních buňkách během jejich heterologní exprese. Z výsledků vyplývá, že nitroreduktasová aktivita CYP1A1, CYP1A2 a CYP1B1 je zprostředkována hydroxylovou skupinou v aktivním místě a jejím zavedením lze u CYP1B1 artificiálně vyvolat nitroreduktasovou aktivitu. Pomocí mutageneze byly také identifikovány aminokyseliny, které se...
|
|
|
Study of function and molecular architecture of fungal nitrilases applicable in biocatalysis
Veselá, Alicja Barbara ; Martínková, Ludmila (vedoucí práce) ; Macek, Tomáš (oponent) ; Teisinger, Jan (oponent)
Nitrilasy jsou enzymy katalyzující hydrolýzu nitrilů na příslušné karboxylové kyseliny a amonné ionty. Tyto enzymy mohou nalézt využití v biokatalýze a bioremediaci pro vyšší nenáročnost, bezpečnost a jednoduchost takto katalyzovaných reakcí před konvenčními metodami hydrolýzy nitrilů. V této práci byly pomocí metody prohledávání databazí vybrány sekvence hypotetických fungálních nitrilas. Jako templáty posloužily aminokyselinové sekvence fungálních nitrilas již dříve charakterizovaných v naší laboratoři. Následně byly nové syntetické geny spolu se zbylými geny z naší nitrilasové knihovny exprimovány v E. coli a poté byly porovnány jejich substrátové specifity a podobnost sekvencí. Arylacetonitrilasy z hub Arthroderma benhamiae (NitAb) a Nectria haematococca (NitNh) byly purifikovány a charakterizovány; byly stanoveny jejich substrátové specifity, kinetické parametry, pH a teplotní profily a velikost podjednotek. NitAb a NitNh spolu s dalšími rekombinantními fungálními nitrilasami byly použity pro hydrolýzu vysokých koncentrací (R,S)-mandelonitrilu v jedné dávce nebo s postupným dávkováním substrátu. Ze studovaných enzymů nitrilasa z Aspergillus niger vykázala nejlepší enantioselektivitu (e.e. pro (R)-mandlovou kyselinu až 97,6 %) a produktivitu enzymu v sušině (až 40 g gsuš -1 ). NitAb byla pouze mírně...
|
|
|
Příprava delečních mutantů lidského cytochromu b5 pomocí genové syntézy
Kotlánová, Iveta ; Martínek, Václav (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
Cytochrom b5 je malý amfipatický protein. Jeho lidská forma se nachází ukotvena ve vnější membráně endoplazmatického retikula a mitochondrií, volně se nachází v červených krvinkách. Skládá se ze dvou domén: Větší hydrofilní doména váže hem, menší hydrofobní doména ukotvuje cytochrom b5 v mikrosomální membráně. Obě domény jsou spojeny linkerem, což je řetězec asi 15 aminokyselin, který dodává proteinu potřebnou flexibilitu. Jeho délka hraje významnou roli při přenášení elektronů na cytochrom P450. Pokud je linkerová doména příliš krátká, cytochrom b5 nedokáže přenášet elektrony na cytochrom P450 a neúčastní se tak reakcí MFO systému. Ostatní funkce jsou však zachovány. Cílem této práce bylo navrhnout a pomocí genové syntézy vytvořit 4 deleční mutanty cytochromu b5. Jejich linkerová doména obsahovala krátké i dlouhé delece, u kterých se předpokládá narušení interakce s cytochromem P450. Součástí práce byla heterologní exprese proteinů pomocí buněk Escherichia coli kmenů XL10-Gold a DH5α. Jako expresní vektory pro transformaci byly použity plasmidy pET-30a(+) a pET-22b. DNA byla z buněk izolována a sekvenací byla ověřena správnost genetického kódu. Klíčová slova: cytochrom b5, heterologní exprese, genová syntéza
|
|
|
Mechanismus působení protinádorového léčiva ellipticinu v cílových tkáních jeho účinku
Mrízová, Iveta
Ellipticin je alkaloid čeledě Apocynaceae, který vykazuje významný protinádorový a anti-HIV účinek. Na metabolismu ellipticinu se podílí cytochromy P450 (CYP) a peroxidasy za vzniku aktivačních a detoxifikačních metabolitů. Již v dřívějších pracích byly identifikovány jednotlivé isoformy CYP, které se podílí na oxidaci ellipticinu v různých tkáních (játra, plíce, ledviny) laboratorního potkana, vhodného modelu ilustrujícího osud ellipticinu v lidském organismu. V této diplomové práce byl studován vliv ellipticinu na obsah a aktivitu cytochromů P450 a na dalších složek MFO systému v tomto zvířecím modelu. Pro stanovení obsahu CYP a dalších složek MFO systému v isolovaných mikrosomech byly využity spektroskopické a elektrochemické metody. Pro stanovení katalytické aktivity CYP a NADPH:cytochrom P450 reduktasy byly využity reakce se specifickými substráty. Z výsledků vyplývá, že u zvířat premedikovaných ellipticinem dochází k zvýšení exprese i katalytické aktivity CYP podrodiny 1A ve všech testovaných orgánech (játra, ledviny, plíce). V játrech navíc dochází vlivem ellipticinu ke zvýšení exprese cytochromu b5 a zvýšení exprese a katalytické aktivity CYP3A. Podobně se i obsah a katalytická aktivita NADPH:cytochrom P450 reduktasy měnila v závislosti na premedikaci zvířat ellipticinem. Cytochrom P450 2S1...
|
host ::
RSS.