|
|
The novel combinations of experimental approaches: mass spectrometry (MS) and photo-induced surface labelling, electron release (PIER), or cross-linking (PIXL)
Tuzhilkin, Roman ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
V živých organismech probíhá každým okamžikem nespočet dějů s účastí přenosu/transportu elektronu (ET). Proto jejich studium je důležitým cílem moderní strukturně-funkční proteomiky. Pro řadu experimentů byl a je používán modelový protein azurin z P. aeruginosa. Tento modrý protein obsahující centrální atom mědi má charakteristické absorpční maximum při 630 nm v redoxním stavu Cu(II). Během jeho oxidace na Cu(I) dochází k poklesu hodnoty absorbance při 630 nm (A630) a tak lze UV-Vis spektra použít pro sledování průběhu jeho ET reakcí. Naším cílem bylo vložit světlem aktivovatelný strukturní analog kanonické aminokyseliny Met - L-2-amino-5,5-azihexanovou kyselinu (foto-Met) - do sekvence azurinu a využít vzniklý proteinový produkt pro studium oligomerizace azurinu v roztoku pomocí techniky světlem iniciovaného síťování (PIXL). Použitím optimalizovaných protokolů pro rekombinantní expresi v E. coli B834 jsme vložili foto-Met do přirozeného azurinu a konstruktu Az2W, ve kterém jsou přítomny dva blízké Trp, u kterých byla potvrzena role při elektronovém přeskoku ("hopping") napříč protein-proteinovým rozhraním. Míra inkorporace foto-Met do sekvence proteinů byla určena pomocí MALDI-TOF MS po separaci proteinů na SDS-PAGE a štěpení proteasou v gelu. Pomocí metody PIXL byl studován vliv rostoucí celkové...
|
|
|
The novel combinations of experimental approaches: mass spectrometry (MS) and photo-induced surface labelling, electron release (PIER), or cross-linking (PIXL)
Tuzhilkin, Roman ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Kavan, Daniel (oponent)
V živých organismech probíhá každým okamžikem nespočet dějů s účastí přenosu/transportu elektronu (ET). Proto jejich studium je důležitým cílem moderní strukturně-funkční proteomiky. Pro řadu experimentů byl a je používán modelový protein azurin z P. aeruginosa. Tento modrý protein obsahující centrální atom mědi má charakteristické absorpční maximum při 630 nm v redoxním stavu Cu(II). Během jeho oxidace na Cu(I) dochází k poklesu hodnoty absorbance při 630 nm (A630) a tak lze UV-Vis spektra použít pro sledování průběhu jeho ET reakcí. Naším cílem bylo vložit světlem aktivovatelný strukturní analog kanonické aminokyseliny Met - L-2-amino-5,5-azihexanovou kyselinu (foto-Met) - do sekvence azurinu a využít vzniklý proteinový produkt pro studium oligomerizace azurinu v roztoku pomocí techniky světlem iniciovaného síťování (PIXL). Použitím optimalizovaných protokolů pro rekombinantní expresi v E. coli B834 jsme vložili foto-Met do přirozeného azurinu a konstruktu Az2W, ve kterém jsou přítomny dva blízké Trp, u kterých byla potvrzena role při elektronovém přeskoku ("hopping") napříč protein-proteinovým rozhraním. Míra inkorporace foto-Met do sekvence proteinů byla určena pomocí MALDI-TOF MS po separaci proteinů na SDS-PAGE a štěpení proteasou v gelu. Pomocí metody PIXL byl studován vliv rostoucí celkové...
|
|
|
Studium strukturně funkčních vztahů elektrotransportních proteinových systémů
Tuzhilkin, Roman ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Kukačka, Zdeněk (oponent)
Studium procesů spojených s přenosem elektronu v proteinech je velice důležitou oblastí moderní biochemie a strukturní/funkční proteomiky. Azurin je jedním z nejpoužívanějších modelových systémů pro studium oxidačně-redukčních a elektron transportních procesů v proteinech. V této práci jsme použili metodiku kovalentního fotochemického zesítění (PIXL) pro studium oligomerizace azurinu v roztoku. Zároveň jsme studovali vliv L-2- amino-5,5-azi-hexanové kyseliny (foto-Met), strukturního světlem indukovatelného analogu přirozené aminokyseliny Met, na elektron transportní procesy v azurinu. Byla provedena optimalizace podmínek exprese rekombinantního azurinu v auxotrofních buňkách E. coli B834 za účelem získání azurinu s maximální mírou inkorporace foto-Met (70% inkorporace určená MALDI-TOF hmotnostní spektrometrií). Současně modifikací purifikačního protokolu (např. rozbití buněk, kyselá precipitace proteinů, zavedení kovového ligandu při sonikaci buněk) jsme zvýšili čistotu a výtěžek preparátu a zkrátili dobu purifikace. Získané preparáty azurinu (přirozený protein (WT) s Met, WT s foto-Met a "All-Phe" mutant (všechny Trp/Tyr zaměněny za Phe) s foto-Met) byly po ozáření UV světlem (metodika PIXL) charakterizovány pomocí UV-VIS spektroskopie a SDS-PAGE. Při experimentu PIXL některý z foto-Met zavedených...
|
host ::
RSS.