|
|
Metodika pro identifikaci cizích amyláz v medu
Erban, Tomáš ; Shcherbachenko, Elena ; Talacko, Pavel ; Harant, Karel
Včelí med je unikátní přírodní produkt. Med je odedávna využíván jako lahodná sladká potravina. Je však ceněn také pro mnohostranné léčivé účinky. Med bohužel patří mezi nejfalšovanější potraviny. Do medu nesmí být nic přidáváno a nesmí být upravován. S medem je také potřeba zacházet opatrně, protože jeho kvalitu může negativně ovlivnit způsob zpracování. Med může výrazně ovlivnit nešetrné rozehřívání. I přes velký pokrok v analytických metodách se nedaří prokázat všechny falšované medy. Některé způsoby falšování jsou totiž dosti sofistikované. Proto je potřeba hledat nové přístupy a metody pro odhalování falšování medu. Aby mohl být med prodáván, musí splňovat mezinárodně platné normy, které platí také na národních úrovních s případnými modifikacemi. Jedním z důležitých parametrů pro med je míra diastázové neboli amylázové enzymové aktivity, která je uznávaným indikátorem čerstvosti a kvality medu. Snížená diastázová aktivita pod stanovenou normu může indikovat starý med, ale může být také důsledkem nešetrného zacházení s medem. V neposlední řadě může být diastázová aktivita snížena v důsledku falšování medu, jako je jeho ředění cukernými náhražkami. Někdy může být amylázová aktivita uměle nastavena přidáním enzymů. Takto falšovaný med sice splní stanovené legislativní požadavky pro uvedení na trh, ale nastavením amylázové aktivity je porušen zákaz o přidávání látek do medu. Dosud používané metody neumožňovaly odhalení takovéhoto způsobu falšování. Proto se tato metodika zaměřuje právě na specifickou identifikaci cizích amyláz, které se mohou v medu vyskytovat. Metodika umožňuje identifikovat bottom-up shotgun proteomickým přístupem prakticky jakoukoliv cizí amylázu v medu. Identifikované specifické peptidy získané na základě tohoto metodického postupu mohou být později využity pro vývoj cílené metody pro identifikaci cizích amyláz.
Plný text:  PDF
|
|
|
Vývoj nových tyrosin vázajících sond pro strukturní charakterizaci proteinů
Karpíšek, Michael ; Kukačka, Zdeněk (vedoucí práce) ; Talacko, Pavel (oponent)
Proteiny jsou základními stavebními kameny živých organismů. Jejich funkce je deter- minována jejich strukturou, a proto jejímu studiu je věnováno mnoho energie a pozornosti. Jednou z technik, která se při studiu struktury proteinů a biomolekul obecně používá, je technika chemického zesítění ve spojení s hmotnostní spektrometrií. Ačkoli bylo již vyvinuto mnoho činidel, většina z nich selektivně váže jen několik aminokyselin, jako jsou lysin, cystein, či kyseliny asparagová a glutamová. V naší práci jsme se zaměřili na vývoj činidel kovalentního značení, které by mohly vázat na tyrosin. Na modelových proteinech byl studován vliv činidel obsahující ve své struktuře ester N-hydroxysukcinimidu či imidazol a to při různých pH přístupy shora dolů (top down) a zdola nahoru (bottom up). Získaná data naznačují, že studovaná činidla mají různou reaktivitu i specifitu. Činidla obsahující imidazolovou skupinu tyrosin modifikovala více, nicméně rozdíly byly malé a vazba na tyrosin nebyla selektivní.
|
|
|
Katepsin L z klíštěte obecného (Ixodes ricinus)
Talacko, Pavel ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Entlicher, Gustav (oponent)
Klíšťata patří mezi významné parazity člověka, kteří přenášejí řadu patogenů. V Evropě je hlavním druhem klíště obecné Ixodes ricinus přenášející bakterii Borrelia burgdorferi (způsobující Lymskou boreliosu) a vir klíšťové encefalitidy. Při trávení proteinů z krve hrají důležitou roli katepsinové proteasy v žaludku klíštěte. Tato práce se zabývá katepsinem L, který je znám jako významná cysteinová trávící proteasa klíšťat. Byl připraven rekombinantní katepsin L z I. ricinus, který byl chromatograficky izolován z kultivačního media expresního systému Pichia pastoris. Izolovaný katepsin L byl charakterizován pomocí N-koncového proteinového sekvenování a pomocí značení fluorescenční aktivitní značkou Green-DCG-04. Analýza substrátové a inhibiční specifity katepsinu L pomocí peptidových substrátů a inhibitorů prokázala Z-FR-AMC jako vhodný substrát s pH optimem 3,5 a Z-FF-DMK jako účinný inhibitor. Byla zjištěna schopnost katepsinu L degradovat proteinové substráty HSA a hemoglobin v silně kyselém prostředí (pH 3,5-4,5). Proteolytická aktivita se stejnými charakteristikami jako byly určeny u rekombinantního katepsinu L byla identifikována v extraktu ze slinných žláz a ve slinách klíštěte I. ricinus. Jde o první nález katepsinové proteasy ve slinách klíšťat. Lze předpokládat, že katepsin L sekretovaný...
|
|
|
Reprodukční a biotechnické metody využitelné v chovu dojeného skotu
Talácko, Pavel
V bakalářské práci jsou zachyceny nejčastější a nejznámější biotechnické metody využitelné v chovu dojeného skotu. Zachycuje inseminační metody využitelné v chovu skotu a seznámení s jejich praktickým využitím. Protože je v praxi nejčastěji používaná tzv. rektální metoda, je na ní v popisu kladen největší důraz. Dále se jedná o embryo-transfér, který je v práci popsán, a to přes získání samotných embryí, hodnocení, uchování až do samotného přenosu. S touto metodou úzce souvisí superovulace a syn-chronizace říje. Obě tyto metody jsou zde také popsány. Dalšími zmíněnými metodami jsou oplození in-vitro a tzv. sexace spermií, která se v dnešní době relativně často využívá. U všech těchto metod jsou uvedeny jejich výhody, ale zároveň jejich nevýhody. V další části se práce ubírá směrem k detekci říje. V první řadě je popsána samotná říje a její příznaky. Při detekci říje je důležité samotné sledování, to je samozřejmě v práci také zachyceno. Najdeme zde i pomůcky, které pomáhají detekovat říji. S tímto tématem souvisí další část práce, jimiž jsou reprodukční ukazatelé, kdy popisovány jsou hlavně mezidobí, servis perioda, inseminační interval, inseminační index, procento zabřezlých po 1. inseminaci. Závěr uvádí současné hodnoty zmíněných ukazatelů v ČR a jejich porovnání se zahraničím.
|
|
|
Katepsin L z klíštěte obecného: analýza proteolytické aktivity a její regulace
Talacko, Pavel ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Ryšlavá, Helena (oponent)
Klíště obecné (Ixodes ricinus) je parazit sající krev, jehož význam spočívá v přenosu patogenů způsobujících klíšťovou encefalitidu nebo lymskou boreliosu. Při trávení proteinů z krve hostitele hrají důležitou roli katepsinové proteasy. Tyto proteiny jsou zajímavé jako antigeny pro vývoj protiklíštěcích vakcín. Tato práce se zabývá katepsinem L z klíštěte obecného, konkrétně isoenzymy IrCL1 a IrCL3. IrCL1 byl exprimován v kvasinkách Pichia pastoris a chromatograficky purifikován z expresního media. Byla určena substrátová specifita IrCL1 pomocí štěpení (a) peptidových fluorogenních substrátů, (b) proteinových substrátů analyzovaných hmotnostní spektrometrií. Proteolytická aktivita IrCL1 byla modulována interakcí s glykosaminoglykany, která ovlivňuje aktivitní pH optimum. Dále byl připraven proteolyticky aktivní mutant IrCL1 s redukovaným počtem N-vázaných oligosacharidů vhodný pro krystalizační experimenty. IrCL3 byl exprimován v Escherichia coli, refoldován a aktivován do funkční formy. Proteolytická aktivita IrCL3 v řadě aspektů připomíná IrCL1 včetně substrátové specifity, kyselého pH optima a modulační interakce s glykosaminoglykany. Klíčová slova: cysteinové proteasy, katepsin L, klíště Ixodes ricinus, substrátová specifita, proteolytická aktivita
|
|
|
Katepsin L z klíštěte obecného (Ixodes ricinus)
Talacko, Pavel ; Entlicher, Gustav (oponent) ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce)
Klíšťata patří mezi významné parazity člověka, kteří přenášejí řadu patogenů. V Evropě je hlavním druhem klíště obecné Ixodes ricinus přenášející bakterii Borrelia burgdorferi (způsobující Lymskou boreliosu) a vir klíšťové encefalitidy. Při trávení proteinů z krve hrají důležitou roli katepsinové proteasy v žaludku klíštěte. Tato práce se zabývá katepsinem L, který je znám jako významná cysteinová trávící proteasa klíšťat. Byl připraven rekombinantní katepsin L z I. ricinus, který byl chromatograficky izolován z kultivačního media expresního systému Pichia pastoris. Izolovaný katepsin L byl charakterizován pomocí N-koncového proteinového sekvenování a pomocí značení fluorescenční aktivitní značkou Green-DCG-04. Analýza substrátové a inhibiční specifity katepsinu L pomocí peptidových substrátů a inhibitorů prokázala Z-FR-AMC jako vhodný substrát s pH optimem 3,5 a Z-FF-DMK jako účinný inhibitor. Byla zjištěna schopnost katepsinu L degradovat proteinové substráty HSA a hemoglobin v silně kyselém prostředí (pH 3,5-4,5). Proteolytická aktivita se stejnými charakteristikami jako byly určeny u rekombinantního katepsinu L byla identifikována v extraktu ze slinných žláz a ve slinách klíštěte I. ricinus. Jde o první nález katepsinové proteasy ve slinách klíšťat. Lze předpokládat, že katepsin L sekretovaný...
|
host ::
RSS.