|
|
Produkce galaktozidázy kvasinkami rodu Cryptococcus rostoucím na laktózovém médiu
Pavlatovská, Barbora ; Molnárová,, Jana (oponent) ; Stratilová, Eva (vedoucí práce)
Tato práce se zabývá studiem indukce - a -galaktosidáz kvasinkami rodu Cryptococcus rostoucím na laktózovém médiu, korelací mezi produkcí těchto enzymů a růstem kvasinek, a jejich následnou biotypizací pomocí hmotnostní spektrometrie. V teoretické části jsou popsány všechny testované a příbuzné kvasinky, hydrolytické enzymy -galaktosidáza a -galaktosidáza, a také použité analytické metody UV-VIS spektrofotometrie a hmotnostní spektrometrie, především MALDI-TOF. Experimentální část obsahuje popis použitého přístrojového vybavení, přípravy potřebných roztoků, kultivace mikroorganismů na laktózovém médiu, měření enzymové aktivity spektrofotometricky a biotypizaci kvasinek hmotnostní spektrofotometrií. Každý z 18 testovaných kmenů kvasinek druhů Cr. carnescens (CCY 17-3-13), Cr. flavescens (CCY 17-3-6, CCY 17-3-15, CCY 17-3-29, CCY 17-3-31, CCY 17-3-33, CCY 17-3-38), Cr. flavus (CCY 17-3-5), Cr. laurentii (CCY 17-3-2, CCY 17-3-9, CCY 17-3-17, CCY 17-3-24), Cr. magnus (CCY 17-4-39, CCY 17-4-40), Cr. saitoi (CCY 17-3-18), Cr. victoriae (CCY 17-3-26) a Bulleromyces albus (CCY17-3-35, CCY 17-3-37) ze Sbírky kultur kvasinek, Chemický ústav SAV (CCY), byl kultivován po dobu 96 hodin v tekutém laktózovém médiu. V průběhu kultivace byl stanovován počet buněk v médiu a enzymová aktivita - a -galaktosidázy v médiu a na povrchu buněk. Laktózové médium nebylo vhodným kultivačním médiem pro všechny kvasinky rodu Cryptococcus, protože některé kmeny na něm rostly pomalu (CCY 17-3-29, CCY 17-3-5, CCY 17-3-26, CCY 17-3-35), nebo vykazovaly dlouhou adaptační fázi (CCY 17-3-2, CCY 17-3-6). Porovnání růstových křivek a grafů produkce aktivit povrchové -galaktosidázy v průběhu kultivace ukázalo, že mezi nimi není žádná blíže specifikovatelná závislost a výsledky tak nepotvrdily očekávaný vliv tohoto enzymu na růst kmene, ani předpokládaný nárůst produkce -galaktosidázy vlivem kultivace na laktóze. Nejrychlejší růst na laktóze vykazoval kmen Cr. carnescens CCY 17-3-13, který produkoval na svém povrchu velmi nízké aktivity tohoto enzymu. Relativně zvýšené množství tohoto enzymu bylo na povrchu kvasinek pozorováno jen v případě typového kmene Cr. laurentii CCY 17-3-2, kmene Cr. flavescens CCY 17-3-31 a Cr. flavus CCY 17-3-5. Stejně tak se značně lišila produkce -galaktosidázy kapsulárními kmeny, což vylučuje předpokládaný vliv tohoto enzymu na přestavbu a degradaci ochranné kryptokokální kapsuly. Výjimku tvořily pouze kmeny Cr. flavescens, které obecně můžeme považovat za producenty povrchové -galaktosidázy indukované laktózovým médiem. V ostatních případech byla produkce tohoto enzymu záležitostí jednotlivého kmene, ne všeobecně druhu, např. v případě typového kmene Cr. laurentii. Obdobná indukce byla ovšem pozorována i u jiných kvasinek a hub, a proto jakákoliv souvislost s kapsulí byla vyloučena. V souvislosti se zvoleným kultivačním médiem bylo druhým cílem práce otestovat vhodnost laktózového média pro biotypizaci kvasinek rodu Cryptococcus hmotnostní spektrometrií. Naměřená čárová hmotnostní spektra vykazují při vzájemném porovnání nízké podobnostní skóre, takže není možné spolehlivě určit, o jaký druh se jedná. Taktéž dělení zástupců rodu Cryptococcus podle fylogenetických linií nebylo programem Biotyper provedeno správně a i blízce si příbuzné kmeny byly zařazeny na odlišné vývojové větve. Výsledky testování tak řadí laktózu k nevhodným médiím pro biotypizaci mikroorganismů hmotnostní spektrometrií.
|
|
|
Vliv kultivačního média na identifikaci kvasinek rodu Cryptococcus hmotnostní spektrometrií
Jurnečková, Alena ; Vadkertiová, Renata (oponent) ; Stratilová, Eva (vedoucí práce)
Rod Cryptococcus je v oblasti klinické mikrobiologie znám pro svoji obtížnou identifikaci a taxonomické zařazení. Pro tuto bakalářskou práci bylo vybráno celkem 22 kmenů kvasinek rodu Cryptococcus. Větší část kmenů byla nejprve sekvenována analýzou D1/D2 domény LSU rRNA genu. Pro kultivaci byly zvoleny tři typy médií – YPD, bramborový a Sabouraudův agar. Vzorky byly upraveny dle normované metody firmy Bruker Daltonik, Chemického ústavu SAV a kombinací těchto dvou metod. Identifikace byla provedena metodou hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF. Získaná spektra byla porovnána příslušným softwarem a vyhodnocena na základě specifického algoritmu. Nejvhodnější médium pro kultivaci a tedy biotypizaci s procentuálně nejvyšším skórem bylo YPD (Yeasts pepton dextrose). Naopak nejméně vhodným kultivačním médiem byl Sabouraudův agar (SA), který dosáhl nejmenší procentuální úspěšnosti dle parametrů daných algoritmem firmy Bruker Daltonik. V případě metod úpravy a aplikace vzorku dosáhla nejvyšší úspěšnosti kombinovaná metoda při použití YPD média. Výsledkem kompletní analýzy jsou dendrogramy pro jednotlivá média zobrazující genetickou podobnost kmenů kvasinek. Dendrogram znázorňuje zařazení jednotlivých kmenů do příslušných skupin. Do fylogenetické skupiny Cr. laurentii I (označení větve v dendrogramu A) byly správně zařazeny kmeny Cr. flavescens (CCY 17-3-28, CCY 17-3-30) a Cr. laurentii (CCY 17-3-2). Přestože kmen Cr. flavus (CCY 17-3-5) vykazuje podobnost s kmenem Cr. flavescens, nepatří do této fylogenetické skupiny. Do fylogenetické skupiny Cr. laurentii II (označení větve B) byly umístěny kmeny Cr. carnescens (CCY 17-3-13) a Cr. victoriae (CCY 17-3-26). Kmeny Cr. magnus (CCY 17-4-39, CCY 17-4-40) se vyznačují podobností s těmito kmeny, ale do fylogenetické skupiny II nepatří. Kmeny Cr. gastricus (CCY 17-5-1) a Cr. diffluens (nezařazený) tvoří větev s označením C. Cr. aerius (CCY 17-4-9), který byl také do této skupiny zařazen, jsme navrhli na sekvenční analýzu, neboť jeho spektrum spíše naznačuje, že se jedná o kmen Cr. diffluens. Větev dendrogramu, nesoucí označení D, obsahuje kmeny Bulleromyces albus (CCY 17-3-35, CCY 17-3-36) a Cr. saitoi (CCY 17-3-18, CCY 17-4-2). Sekvenovaný Cr. albidus (CCY 17-4-1), nesekvenovaný Cr. diffluens (CCY 17-4-13) a Cr. terreus (CCY 17-8-1) se řadí do skupiny označenou písmenem E. Vzhledem k tomu, že sekvenovaný kmen Cr. diffluens se vyskytl už ve skupině C, byl kmen CCY 17-4-13 navržen na sekvenční analýzu. Do této skupiny se řadí také sekvenovaný Cr. aerius (CCY 17-25-1), který však tvoří samostatnou větev v dendrogramu v rámci skupiny. Poslední skupinu, označenou písmenem F, tvoří Cr. macerans (CCY 17-19-3) a také kontrolní kmeny Cr. neoformans var. neoformans (CCY 17-1-4, CCY 17-1-5).
|
|
|
Biotypizace askomycetních kvasinek
Jurnečková, Alena ; Dudášová,, Hana (oponent) ; Stratilová, Eva (vedoucí práce)
Pro biotypizaci MALDI-TOF bylo vybráno celkem 84 izolátů kvasinek například z vody, rostlin, ovocných plodů nebo půdy. Veškeré kmeny byly kultivovány na sladinovém agaru a YPD médiu. Vzorky pro biotypizaci byly upraveny podle metody firmy Bruker Daltonik GmbH, Chemického ústavu SAV a kombinací obou těchto metod. Jednotlivé kmeny byly identifikovány na základě analýzy intracelulárních ribozomálních proteinů hmotnostní spektrometrií MALDI-TOF. V případě nejednoznačnosti výsledků byla u daných kmenů vyizolována DNA a sekvenována doména D1/D2 26S rRNA. Identifikace kmenů byla provedena srovnáním jejich hmotnostních spekter se spektry sekvenovaných kmenů v programu MALDI Biotyper 3.0. Výsledkem byly hodnoty skóre, na jejichž základě byla posouzena vzájemná podobnost kmenů. Z celkového počtu 84 kmenů, jich 18 bylo předem sekvenováno a sloužily tak jako vzorové kmeny pro porovnání s neznámými izoláty. Dohromady 51 kmenů bylo jednoznačně taxonomicky zařazeno do 18 fylogenetických skupin na úrovni druhu. Pro celkem 6 kmenů byla biotypizace hmotnostní spektrometrií MALDI-TOF opakována z důvodu nejednoznačnosti výsledků. U 15 kmenů nebylo taxonomické zařazení jasně určeno, a proto byly navrženy na sekvenaci domény D1/D2 26S rRNA. Pouze jeden kmen z celkového množství nebylo možné na základě sekvenování identifikovat, a proto byla izolace DNA opakována. V případě 8 kmenů byly výsledky sekvenování shodné s původně navrženým taxonomickým zařazením. Naopak zbylých 6 kmenů bylo identifikováno jako jiný druh. U 20 vybraných kmenů byly stanoveny základní charakteristiky pomocí mikrobiologických metod. Byl pozorován vzhled kolonií na tuhém médiu a také vzhled kultur v tekutém médiu. Dále pak byla stanovena konstanta radiálního růstu a přítomnost ureázy. V neposlední řadě bylo provedeno mikroskopické pozorování buněk a kvasná zkouška na sacharidových médiích.
|
|
|
Partial purification and characterization of polygalacturonases of Geotrichum candidum.
Jäger, Jakub ; Breierová, Emília (oponent) ; Stratilová, Eva (vedoucí práce)
This work discusses the possibilities of using microbial degradation of grape pomace, main waste material from wine production, to preparate industrially important enzymes. The issue is focused on the production of pectolytic enzymes, particularly polygalacturonase, by Geotrichum candidum CCY 16-1-29 via solid state fermentation on grape pomace. The theoretical part of the bachelor thesis focuses on studying plant cells and saccharides from which the plant cell wall is made of, mainly pectin. Cell wall sacharides were used as a carbon source for solid state fermentation (SSF) and pectin as an inductor of pectolytic enzymes. This bachelor thesis also deals with the enzymatic degradation of cell wall polysacharides. The greatest attention is paid to degrade pectin and pectolytic enzyme function. Production of pectolytic enzymes is mentioned subsequently. The last chapter from the theoretical part is dedicated to technical use of pectolytic enzymes. In the experimental part of this work I deal with the partial purification and characterization of majority polygalacturonase produced on the seventh day of cultivation, when another increase of extracellular polygalacturonase activity occurred. The yield of cultivation was 43,5 mg of protein extract /100 g of grape pomace. The extract contained protein, and its activity was lyophilisate. Its specific activity was protein. The enzyme was produced in at least four forms differing in pH optimum (4,0; 4,4; 4,8; 5,2). The pH optimum for majority polygalacturonase was 4,8. Action pattern of this enzyme determined as the dependence of polymeric substrate viscosity decrease on its degradation showed that the enzyme is a typical polygalacturonase with random action pattern (EC 3.2.1.15).Value of Km reached indicating a high affinity for this substrate. The amino acid sequence "SNNVVSNVNILSSQVVNSDNGVR" obtained by mass spectrometry after SDS-PAGE and tryptic digestion, was identified as a stretch of primary structure of polygalacturonase of Ap2PG1 G. candidum based on the comparison with proteins from the Uniprot database. It shows the highest similarity with other polygalacturonases of G. candidum S31PG1, S31PG2 and G. klebahnii PSE3. On the basis of this similarity to enzymes produced by phytopathogenic strains of G. candidum and the fact that this enzyme was not produced only in the early stages of cultivation, it can be assumed, that the strain of G. candidum CCY 16-1-29 acted also as a phytopathogenic strain.
|
|
|
Extracelulární enzymové aktivity půdních kvasinek
Pavlatovská, Barbora ; Breierová, Emília (oponent) ; Stratilová, Eva (vedoucí práce)
Předložená práce se zabývá schopností kvasinek, izolovaných z půdy pod ovocnými stromy a z kontaminované půdy oblasti Pernek jihozápadního Slovenska, produkovat extracelulární enzymové aktivity. Celkem bylo screeningu podrobeno 68 kmenů kvasinek náležících k 45 různým druhům a testována byla schopnost produkce polygalakturonáz, lipáz, celuláz, proteáz, -glukosidáz, -amyláz a schopnost tvorby škrobu podobného polysacharidu. V rámci diplomové práce byla také provedena optimalizace metody pro stanovení chitinázové aktivity u kvasinek. Testována byla vhodnost celkem čtyř metod využívající jednak kultivaci na pevném tak v kapalném médiu. Zároveň byla prověřena vhodnost koloidního a nerozpustného chitinu pro kultivaci kvasinek. Jako nejvhodnější byla vyhodnocena kultivace kvasinek v kapalném médiu s koloidním chitinem a následná detekce chitinázové aktivity Ehrlichovým testem. Tato metoda byla posléze použita pro stanovení extracelulární chitinolytické aktivity všech 68 kmenů kvasinek. Více jak 75 % testovaných kvasinek vykazovalo alespoň jednu enzymatickou aktivitu a pouze deset kmenů bylo zcela enzymaticky neaktivních. Nejčastěji produkovanými enzymy byly extracelulární lipázy, proteázy a -glukosidázy a naopak méně častá byla produkce chitináz a celuláz. Širší spektrum enzymatických aktivit vykazovaly kvasinky izolované z půdy pod ovocnými stromy než kvasinky z kontaminovaných půd. Největší produkce extracelulárních enzymů byla pozorována u Aureobasidium pullulans, CCY 27-1-134, který vykazoval všechny testované aktivity, ale neprodukoval polysacharid podobný škrobu. Druhými největšími producenty byly druhy Cystofilobasidium macerans a Tausonia pullulans. Navíc tyto druhy vykazovaly vnitrodruhovou variabilitu v produkci lipáz a polygalakturonáz. Zástupci rodu Cryptococcus byli nejčastěji producenty lipáz, -amyláz a -glukosidáz, ale schopnost produkce jednotlivými kmeny se poměrně výrazně lišila. Pro všechny testované kmeny rodu Galactomyces byla stanovena produkce polygalakturonáz a všechny kmeny rodu Candida a Cyberlindnera produkovaly -glukosidázy. Pro všechny kmeny druhu Galactomyces candidum (CCY 16-3-2, 16-3-4, 16-3-6), Galactomyces pseudocandidus (CCY 16-3-1), Tausonia pullulans (CCY 30-1-15) a Trichosporon asahii (CCY 30-19-1) byly sestaveny aktivitní křivky produkce polygalakturonáz a růstové křivky v průběhu kultivace (168 hodin). Kmen Galactomyces candidum CCY 16-3-2 byl vyhodnocen jako nejlepší producent termostabilních polygalakturonáz, které by bylo vhodné blíže charakterizovat. Výsledky screeningu poukazují na mnohdy výrazný vnitrodruhový rozdíl v produkci enzymatických aktivit, takže pro biotechnologické využití těchto enzymů je vždy nutné vybrat a charakterizovat přímo daný produkční kmen a nelze v tomto směru očekávat shodné chování ani přes jejich prokázanou příbuznost.
|
|
|
Microbial Degradation of Polycaprolactone-based Materials
Damborský, Pavel ; Stratilová, Eva (oponent) ; Hermanová, Soňa (vedoucí práce)
The thesis deals with the issue of the effect of nutritious factors and aeration on Bacillus subtilis (CCM 1999) lipase production, which was studied from the viewpoint of the crucial action of lipases on polyester chains degradation. The parameters such as bacterial growth, lipolytic activity, pH optimum, temperature optimum, thermal stability, proteolytic activity, the amount of proteins, etc. were determined in three types of media inoculated by Bacillus subtilis. One sample set of media: peptone and yeast extract (NB), medium consisted in peptone and yeast extract with the addition of 2% (w/v) glucose (NBG) and mineral solution with yeast extract (MS-YE) contained poly(-caprolactone), PCL film (Mn = 10 kDa, = 1.4). Experiments were performed for 21 days under shaking at 160 and 200 rpm. The presence of PCL caused in both types of media (NB, NBG) higher values of lipolytic activity of Bacillus subtilis indicating the participation of released low-molecular weight species as the products of PCL biodegradation. In BS-inoculated MS-YE medium low lipolytic activity of Bacillus subtilis as compared with those measured in NB and NBG media was determined even in the presence of PCL. During experiment pH value shifted from neutral (pH 7.0) to alkaline (pH 8.5 – 9.3) region for all types of media with and without PCL specimens. This fact indicates negligible pH changes in microenvironment due to the degradation products and/or metabolites. Lipolytic enzymes determined in supernatants free of bacterial cells have shown two pH optima in the presence of PCL, at pH 7 and 9. Lipase in the absence of polymer displayed optimum pH of 7. Measurement of thermal stability demonstrated that extracellular lipases as relative thermostable enzyme especially in the absence of polymer. The basic proteomic analysis by peptide mass fingerprint (PMF) of lipases produced by Bacillus subtilis at NBG medium after one week of cultivation was performed. The presence of proteins with molecular weight (19.3 kDa) close to that reported for lipases was verified through FPLC. Both SDS-PAGE and IEF-PAGE indicated presence of these proteins in both studied media (NBG vs. NBG/PCL). However, no differences have been found in the presence of PCL and no lipase was truly identified through MALDI-TOF mass spectrometry. The occurrence of degradation process in PCL samples was also documented by their gradual weight loss, which was seen in all media types as the synergic effect of lipase- and base-catalyzed ester bond scission. Model degradation study of PCL and its composite with graphene oxide (2.7 wt% GO) was performed in the presence of Bacillus subtilis in NBG medium at 30 °C and initial pH 7 for three weeks. The weight loss of PCL films gradually increased during whole degradation test up to 12 wt%. Degradation of PCL/GO composite proceeds slower as documented by maximum weight loss of 5.0 wt%. The similar character of elution curves of both PCL and its composite, determined by SEC analysis, indicated shifting to lower molecular region.
|
|
|
Vliv složení kultivačního média na hmotnostní spektra kvasinek druhů Cryptococcus laurentii a Cryptococcus flavescens
Ledvina, Vojtěch ; Breierová, Emília (oponent) ; Stratilová, Eva (vedoucí práce)
Cryptococcus laurentii a Cryptococcus flavescens jsou nefermentující kvasinky tvořící extracelulární polysacharidovou kapsuli. Jedná se o saprofytické druhy, nicméně Cr. laurentii je znám i jako oportunní patogen u imunokomprimovaných jedinců. Dříve byl Cr. flavescens považován za synonymum Cr. laurentii, v současnosti je ale klasifikován jako samostatný druh náležící do fylogenetické skupiny I Cr. laurentii. V experimentální části bylo 28 kmenů druhů Cr. laurentii, Cr. flavescens a Cr. victoriae biotypizováno pomocí MALDI-TOF MS. Buňky byly kultivovány na třech různých médiích (Sabouraudův, YPD a bramborový agar) a proteiny byly extrahovány třemi metodami. Sledován byl vliv složení původního média, ze kterého byly kmeny přeočkovány, na kvalitu spekter, vhodnost jednotlivých metod pro různá média, dále zda složení média ovlivňuje kvalitu spekter a na závěr byly všechny kmeny porovnány s typovým kmenem Cr. laurentii CCY 17-3-2. Bylo zjištěno, že vliv původního substrátu nemá zásadní vliv na kvalitu spekter a stejně tak složení kultivačního média. Rozhodující je metoda přípravy vzorku. Nejkvalitnější spektra byla detekována při kultivaci na YPD agaru a promytí buněk ethanolem. Bramborový agar byl shledán nevhodným pro kultivaci kvasinek rodu Cryptococcus, protože při růstu buněk dochází ke značné produkci extracelulárních polysacharidů znesnadňujících extrakci proteinů. Všechny kmeny byly dále srovnány s typovým kmenem Cr. laurentii CCY 17-3-2 a byly vytvořeny MSP dendrogramy na základě podobnosti spekter. Při vzájemném srovnání všech kmenů byly kmeny úspěšně rozděleny na všech médiích do příslušných druhů. V závěru byly srovnány sekvence D1/D2 domén LSU genu vybraných kmenů a fylogenetický strom byl porovnán s MSP denrogramy.
|
|
|
Biotyping of Cryptococcus laurentii group using mass spectrometry
Jäger, Jakub ; Breierová, Emília (oponent) ; Stratilová, Eva (vedoucí práce)
Cryptococcus laurentii has been classically considered a saprophytic species, although several cases of human and animal infection have been already reported. This species is reported to be heterogenous. The taxonomy of yeast Cryptococcus laurentii was always highly ambiguous. The application of molecular biology and bioinformatic methods led to dividing of searched strains to two distinct phylogenetic groups, some varieties were recognized as species and the locution „Cryptococcus laurentii group“ was introduced. The taxonomy of this group is likely not definitive and with advancing knowledge will change. Our aim was the identification of individual species within this group based on matrix-assisted laser desorption/ionization – time of flight mass spectrometry (MALDI – TOF MS), which has recently been described as a rapid, reliable, cost-effective and powerful tool for analyzing of microorganisms, even on variety level. Generally, the yeasts of genus Cryptococcus form highly resistant polysaccharide capsules and produce large amount of extracellular polysaccharides, therefore belong to so called „difficult“ cases for biotyping. The experimental protocol has been optimized for MS analysis of this genus on the selected strains of Cr. neoformans, Cr. laurentii and Cr. magnus from the Culture Collection of Yeasts (CCY).Thirty-three strains, originally classified as Cryptococcus laurentii has been identified by chosen method. These strains were distributed into six different groups according their spectra similarities. It was selected at least one strain of each group, which was classified based on the sequence analysis of the D1/D2 domains of the LSU rRNA gene. This strain (with known sequence) became representative for its group. Type strain of Cryptococcus laurentii (CCY 17-3-2) belongs to the group I. Its MS spectrum of ribosomal proteins differ from mass spectra of all other biotyped species, even with strains identified as Cryptococcus laurentii was the similarity of the spectra low, which could be caused by identification of two different varieties. The group II is represented by Cryptococcus laurentii CCY 17-3-17. Except this strain, thirteen more strains belong to the group II. The group III represents Cryptococcus flavescens CCY 17-3-29. This group included 12 additional strains with almost identical mass spectra. Group IV included only one strain (CCY 17-3-13), which was identified as Cryptococcus carnescens based on gene sequence analysis. Similarly, one representative (CCY 17-3-5) has the group V. Strain CCY 17-3-5 was identified as Cryptococcus flavus. The last group VI of three members represents strain 17-3-35 identified as Bulleromyces albus. While Cr. laurentii and Cr. flavescens belong to phylogenetic group I and Cr. carnescens to the phylogenetic group II, four strains giving two types of different MS spectra and identified as Cr. flavus (1 strain) and Bulleromyces albus (3 strains) were excluded from „Cr. laurentii group.“
|
|
|
Study of yeasts transglycosylases
Čurillová, Natália ; Ing.Hana Schusterová, Ph.D. (oponent) ; Stratilová, Eva (vedoucí práce)
This study is interested in properties of fungal transglycosylases, specifically Phr1, Phr2 and Crh2. These enzymes are involved in the remodelling of yeast cell walls due to their cleavage of structural donor polysaccharides and transfer of their fragments to the other acceptor (poly)saccharide molecules. The mammalian cells do not contain cell walls, nor cell wall transglycosylases, that´s why these enzymes are possible targets for antifungal agents. In this diploma thesis the effect of 67 commercially available inhibitors on Phr1 and Phr2 enzymes was studied by rapid screening. In the case of the Phr1 enzyme, two inhibitors showed a potential effect which was subsequently tested by size exclusion chromatography column incorporated into HPLC device. None of the inhibitors were found to have an inhibitory effect on Phr1 or Phr2 enzymes in contrast to DMSO in which all inhibitors were dissolved. The mode of action of Phr enzymes was also studied by thin layer chromatography and high performance liquid chromatography. The first method allowed to monitor the formation of products only in the later stages of the reaction, but more sensitive size exclusion chromatography showed the product formation at the beginning of the reaction. Phr1 cleaved the donor substrate near the non-reducing end and forms small fragments that are transfered to labeled acceptors during the whole reaction. Phr2 utilized random action pattern, thus creating products with higher molecular weight from the beginning of reaction. The effect of the polymerization degree of acceptor on it´s affinity with the Crh2 was also studied. The Michaelis-Menten constants showed no effect of acceptor lenght on the affinity between enzyme and substrate.
|
|
|
Vybrané laboratorní metody ve výuce chemie: videonávody
Cosentino, Nikola ; Teplý, Pavel (vedoucí práce) ; Stratilová Urválková, Eva (oponent)
Bakalářská práce se zaměřuje na výuku laboratorních metod na ZŠ a SŠ a její podporu výukovými videi. Z porovnání rámcových vzdělávací programů a školních vzdělávacích programů vyplynulo příliš obecné pojetí a malý důraz na laboratorní výuku a rozvoj laboratorních dovedností v základním i středním školství. Dotazníkové šetření mezi vyučujícími chemie nám pomohlo definovat základní vyučované laboratorní metody. Informace z dotazníkového šetření, byly použity při tvorbě videí, konkrétně: práce s kahanem, filtrace a krystalizace. Vytvořená videa byla podrobena zpětné vazbě pomocí druhého dotazníkového šetření, na základě kterého došlo k finální úpravě videí.
|
host ::
RSS.