|
|
Regulace funkce proteinu STING během infekce myším polyomavirem
Šnejdarová, Aneta ; Horníková, Lenka (vedoucí práce) ; Pimková Polidarová, Markéta (oponent)
Stimulator of interferon genes (STING) je adaptorovým proteinem signalisační dráhy vrozené imunity, účastnící se detekce dvouvláknové DNA (dsDNA) v cytoplasmě buňky, která ústí v expresi prozánětlivých genů včetně produkce interferonu I. typu. Během infekce dsDNA virem, myším polyomavirem (MPyV), sice dochází k aktivaci proteinu STING, ale výsledná produkce interferonu je pouze mírná. Lze tedy předpokládat, že v buňkách infikovaných MPyV je funkce proteinu STING regulována. Cílem této diplomové práce bylo prozkoumat tři mechanismy, kterými může k regulaci docházet, a to prostřednictvím proteinových interakčních partnerů, posttranslačních modifikací, nebo změny vnitrobuněčné lokalisace proteinu STING. Pro usnadnění výzkumu byla ustanovena linie myších fibroblastů stabilně exprimující proteinu STING fúzovanou s HA-kotvou. Dále byly připraveny dva plasmidy kódující protein STING fúzovaný se zeleným fluorescenčním proteinem, usnadňující sledování lokalisace proteinu v buňce, či s kompositní kotvou obsahující in vivo biotinylovanou značku BioEaseTM tag umožňující efektivní isolaci proteinu STING. Výsledky pozorování kolokalisace v buňce a koimunoprecipitace naznačují, že by protein STING mohl interagovat s virovým středním T antigenem. Byla nalezena i neočekávaná interakce s virovým velkým T antigenem....
|
|
|
Vesikulární transport z kyselých endosomálních kompartmentů do endoplasmatického retikula
Polidarová, Markéta ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Plocek, Vítězslav (oponent)
Retrográdní transport z endozomů do Golgiho aparátu a dál do endoplasmatického retikula slouží buňkám pro opětovné využití receptorů a dalších proteinů. Existuje řada drah začínající na různých typech endozomů cílená do trans-Golgi síťoviny a z ní dál do endoplasmatického retikula. Z časných a maturujících endozomů jsou proteiny transportovány pomocí retromeru, pro pohyb z pozdních endozomů je zásadní GTPáza Rab9 a v transportu z recyklujících endozomů se uplatňují Rab6 a Rab11. V rámci Golgiho aparátu jsou známé dvě dráhy. Jedna pomocí COPI váčků regulovaná GTPázou Arf1, která je citlivá k brefeldinu A. Druhá dráha je regulována GTPázou Rab6. Retrográdní transport využívají kromě endogenních proteinů také proteinové toxiny a malé neobalené DNA viry. Pro Shiga toxin je charakteristické využívání Rab6 dráhy z recyklujících endozomů i přes Golgiho aparát. Retrográdní transport ricinu začíná na časných endozomech a je méně jasný. Transport malých neobalených DNA virů začínají vědci teprve poodkrývat.
|
|
|
Protein STING targeting for chronic hepatitis B treatment
Pimková Polidarová, Markéta ; Birkuš, Gabriel (vedoucí práce) ; Forstová, Jitka (oponent) ; Rumlová, Michaela (oponent)
Chronická hepatitida B (CHB) je infekční onemocnění způsobené hepatotropním virem hepatitidy B (HBV). CHB celosvětově trpí miliony lidí, ale možnosti léčby tohoto onemocnění jsou stále limitované a k úplně eliminaci viru dochází jen málokdy. V současnosti se začínají zkoumat imunomodulační přístupy v léčbě CHB. V této práci jsme se zaměřili na anti-HBV potenciál dráhy přirozené imunity rozpoznávající DNA, tzv. dráhy syntázy cyklického GMP-AMP-stimulátoru genů pro interferony (cGAS-STING). Aktivace této dráhy vede k sekreci prozánětlivých cytokinů. V naší laboratoři jsme otestovali připravené syntetické aktivátory proteinu STING založené na cyklických dinukleotidech (CDN) a z nich vytvořené lipofilní prolátky v reportérových buněčných liniích a jednojaderných buňkách periferní krve (PBMC). Vybrali jsme kandidátní molekuly, které aktivovaly dráhu cGAS-STING lépe než přirozený eukaryotický aktivátor proteinu STING. Identifikovali jsme, že 3′,3′-c-di(2′-fluoro,2′-deoxyAMP) lépe aktivoval dráhu cGAS-STING napříč pěti isoformami proteinu STING nejvíce zastoupenými v lidské populaci včetně těch, které jsou špatně aktivovány 3′,3′-CDN. Symetrická bis-pivaloyloxymethylová prolátka připravená z 3′,3′-c- di(2′-fluoro,2′-deoxyAMP) dále zlepšila vlastnosti CDN tím, že usnadnila vstup CDN do buňky. Ukázali jsme,...
|
|
| |
|
|
Utilization of mouse polyomavirus derived virus-like particles for cargo delivery into cells
Polidarová, Markéta ; Španielová, Hana (vedoucí práce) ; Šmahel, Michal (oponent)
a klíčová slova Virům podobné částice odvozené od myšího polyomaviru tvořené hlavním kapsidovým proteinem VP1 (MPyV VP1-VLPs) mohou být využity jako systém pro dopravu různých látek do buněk. Protein VP1 je schopný se samouspořádat do ikosahedrálních částic o průměru 45 nm, tedy vysoce pravidelných dutých nanočástic. V této práci byl do MPyV VP1-VLPs zabalen modelový náklad, bimodální malá molekula založená na cyklodextrinu umožňující detekci pomocí fluorescence a zároveň kontrastní látka pro zobrazování pomocí magnetické rezonance. Tento náklad stabilně asocioval s VLPs a byl pomocí těchto částic doručen do savčích buněk. Aby se zabránilo uvíznutí VLPs v endolysozomálních kompartmentech a zvýšilo se tak potenciální využití VLPs, MPyV VP1 protein byl modifikován vložením sekvencí bohatých na histidin (histidinový tag dlouhý 6 histidinů ohraničený glycinem a serinem) do povrchové smyčky DE. Tento přístup byl zvolen, protože modifikace umělých částic histidinem zvýšila jejich únik z endozomů a dopravu látek do buněk. Produkce His-VP1 proteinu v bakulovirovém expresním systému Bac-to-Bac® vedla ke vzniku různých struktur tvořených proteinem VP1: dlouhých tubulárních útvarů a malých 20nm VLPs při produkci VP1 se 4x vloženými histidinovým tagem ve smyčce DE, a nové nanostruktury, které jsme pojmenovali...
|
|
|
Vesikulární transport z kyselých endosomálních kompartmentů do endoplasmatického retikula
Polidarová, Markéta ; Forstová, Jitka (vedoucí práce) ; Plocek, Vítězslav (oponent)
Retrográdní transport z endozomů do Golgiho aparátu a dál do endoplasmatického retikula slouží buňkám pro opětovné využití receptorů a dalších proteinů. Existuje řada drah začínající na různých typech endozomů cílená do trans-Golgi síťoviny a z ní dál do endoplasmatického retikula. Z časných a maturujících endozomů jsou proteiny transportovány pomocí retromeru, pro pohyb z pozdních endozomů je zásadní GTPáza Rab9 a v transportu z recyklujících endozomů se uplatňují Rab6 a Rab11. V rámci Golgiho aparátu jsou známé dvě dráhy. Jedna pomocí COPI váčků regulovaná GTPázou Arf1, která je citlivá k brefeldinu A. Druhá dráha je regulována GTPázou Rab6. Retrográdní transport využívají kromě endogenních proteinů také proteinové toxiny a malé neobalené DNA viry. Pro Shiga toxin je charakteristické využívání Rab6 dráhy z recyklujících endozomů i přes Golgiho aparát. Retrográdní transport ricinu začíná na časných endozomech a je méně jasný. Transport malých neobalených DNA virů začínají vědci teprve poodkrývat.
|
host ::
RSS.