|
Variabilita exprese a umlčování transgenů v rostlinách bramboru a v buněčné linii tabáku BY-2
Nocarová, Eva ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Moravec, Tomáš (oponent) ; Kovařík, Aleš (oponent)
Závěry U suspenzních kultur buněčné linie tabáku BY-2 odvozených z kalusů po transformaci bylo po transformaci téměř 90 % linií tvořeno buňkami s různou mírou fluorescence GFP. Nově zavedená metoda klonování umožnila získání téměř poloviny klonů s homogenní expresí GFP z primárně heterogenních linií BY-2. Heterogenita exprese GFP u transgenních linií BY-2 měla původ jednak genetický (primární linie obsahovaly buňky s různými inzercemi T-DNA) a jednak epigenetický. Epigenetická heterogenita linií BY-2 souvisela s umlčováním transgenů, tvorbou stabilních epigenetických stavů brzy po transformaci a "permanentní heterogenitou" projevující se kolísavými změnami v expresi GFP. Snížení nebo umlčení exprese transgenů u bramboru bylo pozorováno přednostně u linií s vyšším počtem insercí T-DNA a s vyšší počáteční expresí GFP. Umlčení vždy postupně postihlo oba vnesené geny, přičemž vymizení exprese GFP předcházelo (v řádu měsíců) ve všech sledovaných případech ztrátě rezistence ke kanamycinu (umlčení genu NPTII), což naznačuje vzájemné propojení mezi umlčováním obou transgenů. Stejná posloupnost v umlčení obou transgenů byla také pozorována u umlčených linií po obnovení exprese transgenů 5-azacytidinem, který způsobuje demetylaci DNA. Byl navržen možný mechanismus postupného umlčování transgenů v rámci celých rostlin...
|
| |
|
Silencing of Transposable Elements in Plants and Implications for Rationalised Transgene Design
Tobiáš, Andrej ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Moravec, Tomáš (oponent)
(česky) Transponovatelné elementy (TE) jsou nedílnou součástí všech rostlinných genomů. Jejich schopnost změnit svoji pozici, tedy transponovat, jim umožňuje množit se a navozovat mutace, což po miliardy let pohání evoluci vpřed. Ačkoliv jsou TE důležité, jejich ničím nekontrolovaná transpozice může vést k nevratnému poškození genomu. Rostliny proto vyvinuly speciální umlčovací mechanismy, které aktivitu TE regulují a umožňují rostlině využívat jejich mutagenní potenciál, tím že je po jejich transpozici mohou přetvořit v genomické novinky. Mechanismy umlčování převážně působí na epigenetické/transkripční úrovni, kde cíleně zavádějí methylaci DNA nebo histonů, jako je například RNA-dependentní DNA metylační dráha (RdDM). Na posttranskripční úrovni pak cíleně degradují mRNA, což je známé jako posttranskripční genový silencing (PTGS). Tyto silencing mechanismy se postupem času také staly vysoce účinnými v rozpoznávání přirozených i umělých transgenů. Rozpoznání a následné umlčení transgenů snižuje účinnost transgenoze a tím i úspěšnost vývoje geneticky modifikovaných organismů (GMO). Důkladný výzkum těchto umlčovacích drah a TE může vést k lepšímu porozumění toho, co tyto dráhy považují za své cíle. Tato znalost může být využita pro racionalizované navrhování transgenů a lepší vývoj GMO. V tomto textu...
|
|
Přímý vstřik benzínu
Moravec, Tomáš ; Janoušek, Michal (oponent) ; Dundálek, Radim (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá přímým vstřikováním benzínu u osobních automobilů. V první kapitole se dozvíme o historii přímého vstřikování benzínu a vývoji jednotlivých automobilových koncepcí. Dále se zaměříme na vznik směsí paliva se vzduchem a podrobněji rozebereme celý vstřikovací systém. Obsahem mé práce je také seznam vybraných motorů využívajících přímého vstřikování benzínu. Poslední kapitola je zaměřena především na budoucí vývoj přímého vstřikování benzínu u vznětových motorů.
|
|
Konstrukční návrh a optimalizace třmenu vstřikovače
Moravec, Tomáš ; Prokop, Aleš (oponent) ; Řehák, Kamil (vedoucí práce)
Diplomová práce na téma „konstrukční návrh a optimalizace třmenu vstřikovače“ se zabývá návrhem upínacího třmenu, jehož funkcí je zajištění přesné polohy vstřikovače systému Common Rail. Tvar třmenu vstřikovače je navrhován v modelovacím programu, a to jak s ohledem na zástavbový prostor spalovacího motoru, tak na způsob výroby. Navržená geometrie je následně podrobována napěťové analýze v programu využívající metodu konečných prvků. Konečnou fází návrhu je optimalizace geometrie třmenu vstřikovače s využitím stejné metody za účelem snížení hmotnosti komponentu.
|
|
AGO-hook domény v metylaci DNA řízené malými RNA u Arabidopsis thaliana
Teznerová, Kateřina ; Čermák, Vojtěch (vedoucí práce) ; Moravec, Tomáš (oponent)
Metylace DNA řízená malými RNA (RdDM) je důležitá dráha, jež prostřednictvím navození metylace DNA reguluje genovou expresi a podílí se na obraně proti invazivním DNA elementům (zejména transposonům). Klíčovou roli v RdDM dráze hrají proteiny Argonaut (AGO) s malými RNA (sRNA), které jsou k cílové DNA sekvenčně komplementární. S proteiny Argonaut jsou schopné interagovat domény zvané AGO-hooky. U rostlin se v RdDM dráze uplatňují dva proteiny s AGO-hook doménami: NRPE1 a SPT5L. Na řešitelském pracovišti bylo nedávno objeveno, že součástí komplexu Pol V (stejně jako zmíněné dva proteiny) je ještě třetí protein SPT6L. Role SPT6L role dosud nebyla popsána, ale předpokládáme, že rovněž hraje roli v RdDM dráze. Tato práce se zabývá studiem všech tří AGO-hook domén přítomných v Pol V komplexu a jejich rolí v RdDM dráze u rostliny Arabidopsis thaliana, od přípravy mutantů postrádajících různé kombinace uvedených AGO-hook domén po studium jejich role a zastupitelnosti při metylaci DNA v různých lokusech. Klíčová slova AGO-hook, Arabidopsis thaliana, NRPE1, SPT5L, SPT6L, siRNA, epigenetické značení chromatinu, protein Argonaut
|
|
Metylace DNA řízená malými RNA u Arabidopsis thaliana
Motylová, Šárka ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Moravec, Tomáš (oponent)
Rozdílná transkripční aktivita různých oblastí genomu je zajišťována epigenetickými modifikacemi, mezi které patří metylace DNA, úprava N-koncových aminokyselin histonů a změny v zastoupení histonových variant. RNA interference je regulační proces, při kterém dochází prostřednictvím malých RNA odvozených z exogenních či endogenních sekvencí k posttrankripčnímu nebo transkripčnímu umlčení těchto sekvencí. 24-nukleotidové siRNA, tvořící část malých RNA, řídí de novo metylaci a spoluúčastní se udržování metylace DNA (RNA-directed DNA methylation; RdDM), která se podílí na transkripčním umlčení heterochromatinu a transponovatelných elementů, vyskytujících se u rostlin ve velkém množství. Pro krytosemenné je také charakteristická přítomnost RNA polymeráz IV a V účastnících se v této dráze, které byly poprvé objeveny v genomu Arabidopsis thaliana, jež se stala hlavní modelovou rostlinou i pro studium RdDM. Polymeráza IV přepisuje prekurzory siRNA; siRNA jsou následně asociované s AGO4 proteiny a navádějí metylační enzymy na cílové sekvence prostřednictvím komplementarity s transkripty polymerázy V.
|
|
Studium mechanismu posttranskripčního a transkripčního umlčování transgenů v buněčné linii tabáku BY-2
Čermák, Vojtěch ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Moravec, Tomáš (oponent)
RNA interference je jedním z mechanismů, který umožňuje buňkám regulovat aktivitu genů, ovlivňovat tvorbu a udržování heterochromatinu a chránit je před invazivními nukleovými kyselinami. U rostlin je RNA interference spouštěna přítomností dvoušroubovicové RNA, která je štěpena proteinem Dicer na malé RNA o délce převážně 20-24nt. Tyto malé RNA mohou v komplexu s proteinem Argonaut na základě sekvenční komplementarity řídit štěpení mRNA, blokování translace, či modifikace chromatinu. V důsledku tak může být genová exprese umlčována buď posttranskripčně (tím že je bráněno vzniku proteinu z již vytvořené mRNA, PTGS) a nebo transkripčně (tím že je bráněno vzniku transkriptu, TGS). Záměrem této práce bylo připravení různých způsobů spouštění posttranskripčního umlčování a porovnání jejich funkčnosti a účinnosti. Dalším krokem pak byla příprava systému, který by měl umožnit sledování jednotlivých kroků přechodu posttranskripčního umlčování na umlčování transkripční. Tyto tzv. indikátorové linie by měly dovolit sledovat časování a dynamiku tohoto procesu s využitím fluorescenčních proteinů. Připravovaný systém umožní také vyhodnocení různých faktorů na průběh tohoto procesu - jedním z nich je RNA-dependentní RNA polymeráza 6, která hraje hlavní roli v samovolném spouštění PTGS. V práci je použita jako modelový...
|
|
Nařízení o úpadku 1346/2000/ES COMI
Moravec, Tomáš ; Brodec, Jan (vedoucí práce) ; Dobiáš, Petr (oponent)
Práce se zabývá problematikou COMI a úpravou COMI v nařízení o úpadku. Zaměřuje se na určení COMI pro fyzické a právnické osoby a dále na základě jakých skutečností je možné vyvrátit domněnku COMI v místě zapsaného sídla právnické osoby. V práce je také rozebrána judikatura Evropského soudního dvora a národních členských států, která se týká COMI. Přiblížena je i navrhovaná úprava a revize nařízení o úpadku. Poté je rozebrána problematika forum shopping a možnost přemístění COMI do jiného členského státu. Taktéž se práce zaměřuje na určení COMI u koncernových dlužníků.
|
|
In planta produkce nanočástic specifické délky s použitím RNA a obalového proteinu Viru tabákové mozaiky (TMV)
Dlabalová, Lucie ; Moravec, Tomáš (vedoucí práce) ; Šafářová, Dana (oponent)
Virus tabákové mozaiky je jedním z vůbec nejprozkoumanějších virů, jeho vlastnosti a struktura jsou plně známy. Z tohoto důvodu byl v této práci vybrán jako biotemplát pro tvorbu nanočástice nastavitelné délky. Pokud je za fyziologických podmínek přítomna jak virová RNA, tak obalový protein, částice jsou schopny se samouspořádat a jejich délka je závislá na délce balené RNA. Podmínkou přednostního balení virové RNA je přítomnost enkapsidačního signálu, který byl identifikován již v 80. letech. V této práci jsme vytvořili dvoukomponentový systém, kdy byly rostliny Nicotiana bentamiana infikovány defektní RNA (dRNA) určenou k zabalení a RNA pomocného viru poskytující všechny komponenty nutné pro replikaci a balení dRNA. V RNA pomocného viru byl navíc vyřazen enkapsidační signál, aby nedocházelo k balení nesprávně dlouhých částic. Některé námi vytvořené pomocné viry navíc obsahovaly obalový protein modifikovaný v oblasti vnitřního kanálu částice. Tato modifikace by měla v budoucnu umožnit specifické vyplnění částic kovem. V rámci práce bylo připraveno několik variant jak dRNA, tak i pomocných virů, aby bylo možné identifikovat jednotlivé oblasti důležité pro replikaci, stabilitu a enkapsidaci vznikajících nanočástic. U rostlin infikovaných jednotlivými systémy jsme poté zjišťovali hlavně to, zda došlo...
|