|
|
Reorganization of in vitro reconstituted actin-based networks
Sabó, Ján ; Lánský, Zdeněk (vedoucí práce) ; Varga, Vladimír (oponent) ; Cifra, Michal (oponent)
Cytoskelet poskytuje živým organismům nástroje k pohybu. V molekulárním měřítku procházejí stejné složky cytoskeletu neustálou reorganizací, aby přispívaly k různým buněčným procesům, jako je například navigace neuronálních růstových kónů v procesu vývoje mozku nebo vytváření chirálních aktinových toků během buněčného dělení. Během vývoje mozku je navigace neuronálních růstových kónů umožňena vzájemými interakcemi mezi sítěmi aktinových vláken a mikrotubuly (v angličtině "cytoskeletal crosstalk"). V růstových kónech byla část těchto intra-cytoskeletálních interakcí spojena s významnou mikrotubulární polymerázou CKAP5 (homolog XMAP215, MSPS, Zyg9). Nicméně role CKAP5 v molekulárním mechanismu remodelace mikrotubulů i aktinových sítí zatím nebyla objasněna. K lepšímu pochopení molekulárího mechanismu jsme použili fluorescenční mikroskopii s úplným vnitřním odrazem (TIRF, z angl. "total internal reflection fluorescence") v kombinaci s in vitro rekonstituovanými mikrotubuly a sítěmi aktinových vláken, které jsme pozorovali v přítomnosti rekombinantních proteinů. V této práci ukazujeme, že CKAP5 vytváří svazky z aktinových vláken (jak náhodně, tak paralelně orientovaných), propojuje aktinová vlákna s mikrotubuly bez ohledu na jejich polaritu, a dále umožňuje umístění aktinových svazků podél "šablon" z...
|
|
|
The role of CKAP5 in mediating crosstalk between actin and microtubule cytoskeleton
Dujava Ždímalová, Michaela ; Lánský, Zdeněk (vedoucí práce) ; Middelkoop, Teije Corneel (oponent)
Dynamické zmeny v usporiadaní cytoskeletu sú nevyhnutné pre mnoho dôležitých udalostí v živote buniek. Jedným z príkladov je navigácia rastu neurónov k ich správnym cieľom. K tomuto procesu slúžia špeciálne axonálne štruktúry známe ako neurónové rastové kužele, ktoré slúžia ako dynamické senzory a navigátory. Regulácia dynamiky ich aktínového a mikrotubulárneho cytoskeletu vedie k riadenému rastu axónov smerom k hľadaným cieľom, čo je kľúčové pre procesy ako tvorba synapsií alebo ich regenerácia. Proteín CKAP5 bol nedávno navrhnutý ako potenciálny regulátor komunikácie medzi aktínom a mikrotubulami v rastových kužeľoch, pričom táto komunikácia je nevyhnutá pre ich správne fungovanie. V tejto práci kombinujeme in vitro rekonštitučné experimenty s TIRF mikroskopiou za cieľom detailne preskú- mať mechanizmus tejto interakcie. Naše výsledky demonštrujú, že CKAP5 (pôvodne známy hlavne ako mikrotubulárna polymeráza) je tiež schopný interagovať s aktínovými vláknami a navyše ich prepájať s mikrotubulami. Ďalej popisujeme pozoruhodné správanie dynamického systému obsahujúceho CKAP5, mikrotubuly a aktínové vlákna, kedy CKAP5 formuje aktínové zväzky pozdĺž dynamických mikrotubúl. Zaujímavé je, že aj po depolymer- izácii mikrotubulu sa príslušný aktínový zväzok nerozpadá, ale pretrváva a slúži ako "koľajnica"...
|
|
|
Optineurin as a regulator of intracellular transport
Ondrúšková, Denisa ; Lánský, Zdeněk (vedoucí práce) ; Štěpánek, Luděk (oponent)
Vnútrobunkový transport mitochondrií a ďalších bunkových komponentov pozdĺž mikrotubulov je nevyhnutný pre všetky bunky a najmä pre neuróny. Anterográdny mitochondriálny transport je poháňaný molekulárnym motorom, kinezínom-1 (KIF5), ktorý je cez adaptorový proteín TRAK1 prepojený s mitochondriou. Optineurín (OPTN) bol iba nedávno objavený ako nový regulátor tohto mitochondriálneho transportu. V našej nedávnej štúdii sme spolu s našimi spolupracovníkmi ukázali, že anterográdny mitochondriálny transport u myší je regulovaný Optineurínom. Taktiež sme ukázali, že OPTN je proteín associovaný s mikrotubulami (MAP), ktorý môže interagovať s KIF5B-TRAK1 komplexom, a tým predĺžiť jeho prejdenú vzdialenosť, čas zotrvania a množstvo dopadov na mikrotubuly. Keďže OPTN je novým proteínom asociovaným s mikrotubulami iba veľmi málo sa vie o jeho spôsobe interakcie s mikrotubulami. V tejto práci ukazujeme ako OPTN interaguje s rôzne post- translačne modifikovanými mikrotubulami a rôznymi izoformami mikrotubulov. Pomocou in vitro rekonštitúcie sme ukázali, že OPTN uprednostňuje nemodifikované pred vysoko post- translačne modifikovanými mikrotubulmi a vytvára na nich oblasti s vysokou afinitou (patches). Okrem toho sa ukázalo, že OPTN má výrazne vyššiu afinitu k α1β4 izoforme v porovnaní s α1β3 izoformou. Avšak, na...
|
|
|
Role of tau phosphorylation in formation of tau envelopes
Karhanová, Adéla ; Lánský, Zdeněk (vedoucí práce) ; Štěpánek, Luděk (oponent)
Tau je nestrukturovaný protein asociovaný s mikrotubuly důležitý pro vývoj axonů a kritický regulátor funkcí mikrotubulů v axonech. Aktivita Tau je řízena fosforylací a její deregulace vedoucí k hyperfosforylaci a agregaci tau je spojena s četnými neurodegenerativními poruchami, souhrnně nazývanými tauopatie. Na mikrotubulech se molekuly tau segregují do dvou kineticky odlišných fází, které se skládají buď z nezávisle difundujících molekul, nebo interagujících molekul, které tvoří soudržné "obálky" kolem mikrotubulů. Tau obálky regulují působení jiných proteinů asociaovaných s mikrotubuly, jako je pohyb molekulárních motorů, a chrání mikrotubuly před degradací enzymy rozdělujícími mikrotubuly. Jak je však formace, dynamika a funkce tau obálek regulována, není známo. Zde ukazujeme, že fosforylace tau brání tvorbě a fungování ochranných tau obálek. Pomocí kombinace rekonstitučních experimentů a zobrazování živých buněk ukazujeme, že fosforylovaný tau se zabudovává do tau obálek a že zpomaluje růst těchto obálek. Důležité je, že demonstrujeme, že fosforylace tau také destabilizuje již existující obálky, což vede k jejich rozpadu. Naše výsledky ukazují, že fosforylace tau interferuje s tvorbou a udržováním ochranných tau obálek in vitro a in vivo, což vede k nestabilitě mikrotubulů. Protože...
|
|
|
Vliv sterické exkluze na biochemickou aktivitu molekulárních motorů
Brucknerová, Adéla ; Lánský, Zdeněk (vedoucí práce) ; Hendrych, Tomáš (oponent)
Bakalářská práce: Vliv sterické exkluze na biochemickou aktivitu molekulárních motorů Adéla Brucknerová, 2022 Cytoskelet a s ním spojené proteiny, tzv. molekulární motory, jsou součástí buněčného aparátu všech eukaryotických buněk. Molekulární motory, mezi něž patří kinesin-1, mají schopnost se na cytoskelet dočasně vázat a přenášet po něm v rámci buňky váčky s nákladem (např. organelou). Při tomto pohybu štěpí molekuly kinesinu-1 pro každý krok v rámci chemomechanického cyklu molekulu ATP. Ukazuje se, že průběh chemomechanického cyklu molekulárních motorů může být ovlivněn přítomností inertních makromolekul, ale jak tyto molekuly ovlivňují kinesin, není zcela známo. Pomocí fluorescenční mikroskopie s totálním vnitřním odrazem byly in vitro zobrazovány jednotlivé molekuly kinesinu-1, byl snímán jejich pohyb po rekonstituovaných mikrotubulech a měřena jejich průměrná rychlost. Experimenty probíhaly při různých koncentracích inertních makromolekul, polyethylenglykolu, o molárních hmotnostech 6 kg/mol, 1000 kg/mol a jejich kombinací. Z rychlosti pohybu kinesinů byla zjištěna jejich biochemická aktivita (hydrolýza molekul ATP) při různých koncentracích polyethylenglykolu. Ve shodě s předchozími výzkumy se ukázalo, že makromolekuly velikostně podobné rozměrům motorové domény kinesinů významně snižují...
|
|
|
Identification and characterization of ciliary tip proteins
Gorilák, Peter ; Varga, Vladimír (vedoucí práce) ; Lánský, Zdeněk (oponent) ; Dean, Samuel (oponent)
Distální konec řasinky/bičíku, také známý jako doména ciliární špičky (CTD), je nepostradatelná pro strukturu a funkci eukaryotických řasinek. Lepšímu porozumění této domény brání nedostatečné znalosti jejích proteinových komponentů. Cílem dizertační práce bylo ověřit lokalizaci vybraných známých proteinů CTD savčích řasinek, a testovat lokalizaci kandidátních CTD proteinů, jejichž ortology se nacházejí na špičce bičíku evolučne vzdáleného prvoka Trypanosoma brucei. Pomocí našeho lokalizačního postupu jsme identifikovali dva proteiny, které výrazně lokalizují do CTD primární řasinky. Jeden z těchto proteinů, ZC2HC1C, navíc také lokalizuje do stacionárních bodů podél axonemy, jejichž pozice se shodují s místy zastavení a otáčení intraflagelárních vlaků. Předpokládáme, že se může jednat o konce sub-distálně končících axonemalních mikrotubulů. Dále prokazujeme, že protein ULK4 lokalizuje do CTD pohyblivých ependymálních řasinek, ale ne do CTD primárnich řasinek, což je v souladu s dříve publikovanými fenotypy u ULK4 knock- outových myší a dokládá rozdíly ve složení CTD těchto dvou typů řasinek. Nakonec jsme ukázali, že Expanzní mikroskopie je rychlá a robustní super-rezoluční metoda, vhodná pro ultrastrukturální a lokalizační studie CTD savčích řasinek a bičíků T. brucei.
|
|
|
Mechanisms of symmetry breaking during embryogenesis
Ždímalová, Michaela ; Lánský, Zdeněk (vedoucí práce) ; Búran, Peter (oponent)
Narušenie pravo-ľavej symetrie je dôležitá súčasť správneho vývinu tela mnohých orga- nizmov, vrátane ľudí. Skutočnosť, že pravo-ľavá asymetria je ustanovená vo všetkých jedincoch daného druhu v konzistentnom smere, fascinuje vedcov už dlhý čas. Aj keď niekoľko navrhnutých alebo už všeobecne prijímaných modelov popisuje mechanizmus tohto deja, väčšina z nich buď nepokrýva všetky prípady alebo ich molekulárny mechaniz- mus nie je preskúmaný do hĺbky. Výraznú pozornosť získava v súčasnej literatúre model akto-myozínových tokov, ktoré sú poháňané rotujúcim pohybom vznikajúcim v akto- myozínovom kortexe. Táto práca predstavuje problematiku akto-myozínových tokov, ako aj poskytuje prehľad o predchádzajúcom výskume. Keďže pravo-ľavá asymetria úzko súvisí s chiralitou na rôznych úrovniach, v tejto práci sú tiež diskutované súčasné znalosti o možnom procese prenosu chirality z molekúl na vyššiu úroveň. 1
|
|
| |
|
|
Regulace štěpení mikrotubulů kataninem
Podhájecký, Roman ; Lánský, Zdeněk (vedoucí práce) ; Libusová, Lenka (oponent)
Cytoskelet je dynamický systém, který se podílí na mnoha buněčných procesech, jako například buněčné dělenínebo buněčná motilita. Katanin je protein asociovaný s mikrotubuly, jehož klíčová vlastnost je štěpení mikrotubulů. Štěpení mikrotubulů je důležité pro amplifikaci a organizaci mikrotubulových sítí. Nicméně přesná kon- trola Kataninové aktivity je nutná, protože dysregulace Kataninové aktivity vede těžkým vývojovým vadám. V této práci jsme prozkoumali lokalizaci Kataninu do mikrotubulových překřížení a důsledky post-translačních modifikací tubulinu na aktivitu Kataninu. Pozorovali jsme, že lokalizace Kataninu do mikrotubulových překříženíje jeho přirozená vlastnost a podjednotka p80 se na lokalizaci Kataninu do překřížení nepodílí. Z našich výsledků vyplývá, že podjednotka p80 se do překřížení lokalizuje skrze neznámého interakčního partnera. Také jsme charakterizovali vázání Kataninu na mikrotubuly a schopnost Kataninu štěpit je v kontextu různých post- translačních modifikací a tubulinových isotypů. Nehledě na vyšší affinitu Kataninu ke značně modifikovaným mikrotubulům, schopnost Kataninu štěpit je byla nižší v porovnání s méně modifikovanými mikrotubuly. Naše...
|
|
|
MAP code and regulation of microtubule-based processes
Karhanová, Adéla ; Lánský, Zdeněk (vedoucí práce) ; Tomášová, Štěpánka (oponent)
Proteiny asociované s mikrotubuly (MAPs) jsou považovány za klíčové regulátory molekulárního transportu v buňkách. Ačkoli jejich nesprávné fungování vede k závažným patologiím, jako jsou neurodegenerativní poruchy, regulační role těchto proteinů zůstávají nejasné. Jelikož se MAPs váží na cytoskelet, musí být tato struktura pro funkci MAPs zásadní. Mikrotubulům, vysoce dynamickému typu cytoskeletální struktury, byla věnována zvláštní pozornost kvůli jeho asociaci s buněčným dělením a vitálními funkcemi v neuronech. Mikrotubuly mohou projít post-translačními úpravami, které ovlivňují molekulární motory a také vazbu dalších proteinů, jako jsou MAPs. Doposud není dostatečně zdokumentováno, jestli post-translační úpravy mikrotubulů regulují distribuci MAPs. Ukázalo se však, že MAPs spolupracují na vytváření soudržných obalů na mikrotubulech a regulují přístup molekulárních motorů a enzymů rozdělujících mikrotubuly. Jelikož existuje mnoho typů MAPs a ty se vzájemně vylučují, objevila se nedávno v literatuře hypotéza regulačního ‚MAP kódu '. Pomocí dostupné literatury se tato práce pokusí představit nový model MAP kódu a poskytnout některé základní informace o předchozím výzkumu v tomto tématu.
|
host ::
RSS.