|
|
Spliceosome assembly
Hausnerová, Viola ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Chalupníková, Kateřina (oponent)
Introny jsou vystřiženy z eukaryotických transkriptů a exony jsou spojeny dohromady během procesu zvaného sestřih pre-mRNA. Sestřih je katalyzován sestřihovým komplexem. Jedná se o velký ribonukleoproteinový komplex složený z pěti malých jaderných RNA a více než stovky proteinů. Tento komplex rozpoznává 5' sestřihové místo, místo větvení a 3' sestřihové místo a následně provádí dvě transesterifikační reakce, jejichž výsledkem je zralá molekula mRNA. V rámci časného sestřihového komplexu je 5' sestřihové místo definováno pomocí U1 snRNP a na rozpoznání místa větvení a 3' sestřihového místa se podílí U2 pomocný faktor (U2 auxiliary factor, U2AF). Spolupráce sestřihových míst byla částečně popsána in vitro, ale situace in vivo není dosud zcela objasněna. V této studii jsme použili fluorescenční rezonanční energetický transfer (Fluorescence resonance energy transfer, FRET) a RNA imunoprecipitaci (RIP) k popsání časných kroků skládání sestřihového komplexu. Abychom detekovali interakce proteinů na RNA molekule přímo v buněčném jádře, uplatnili jsme sestřihové reportéry kódující -globinový gen a vlásenky z fága MS2. Výsledky FRETu ukazují, že intaktní 5' sestřihové místo je vyžadováno pro vazbu U2AF35 na 3' sestřihové místo a že vazba U1C je částečně omezena v přítomnosti mutace 3' sestřihového místa. Dále jsme...
|
|
|
Regulation of pre-mRNA splicing in S. cerevisiae: where RNA cooperates with proteins.
Gahura, Ondřej ; Půta, František (vedoucí práce) ; Pospíšek, Martin (oponent) ; Staněk, David (oponent)
Ondřej Gahura, Dizertační práce 2011 Regulace sestřihu pre-mRNA v S. cerevisiae: kooperace RNA a proteinů Abstrakt Odstraňování intronů z transkriptů probíhá prostřednictvím sestřihu v reakci katalyzované velkým jaderným komplexem - spliceosomem. Sestřih je nesmírně komplikovaný a dynamický proces, v němž koordinované fungování pěti malých molekul RNA a řady proteinů zajišťuje splnění požadavků na extrémní přesnost a flexibilitu. Pro důkladné pochopení sestřihu pre-mRNA je nezbytné rozklíčovat role jednotlivých komponent spliceosomu a porozumět všem dílčím mechanismům. První část práce se zabývá rolí sestřihového faktoru Prp45 v kvasince Saccharomyces cerevisiae. Mapování genetických interakcí alely prp45(1-169) ukazuje na vztah mezi Prp45, NTC komplexem a druhým sestřihovým krokem. Analýza interakcí pomocí dvouhybridního systému a purifikace sestřihových komplexů dokladuje roli C-koncové části Prp45 v regulaci a/nebo vyvazování helikázy Prp22 do spliceosomu. Experimenty s reportérovými substráty prokazují, že Prp45 je vyžadován pro efektivní sestřih určité skupiny intronů. Naše pozorování podporují hypotézu, že role Prp45 v sestřihu je konzervována v evoluci. Druhá část práce je věnována studiu vlivusekundárních struktur intronů na identifikaci 3' sestřihových míst (3' splice site; 3'ss). Ukázali jsme, že...
|
|
|
Regulace pre-mRNA sestřihu v prostředí buněčného jádra
Hnilicová, Jarmila ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Půta, František (oponent) ; Dvořák, Michal (oponent)
Eukaryotní geny obsahují nekódující sekvence - introny, které jsou z pre-mRNA odstraňovány sestřihovými komplexy. Sestřihové komplexy se skládají z pěti RNA-proteinových podjednotek (U1, U2, U4/U6 a U5), které postupně nasedají na pre-mRNA a jsou společně s dalšími bílkovinami nutné pro vystřižení intronu. Mutace v bílkovinách důležitých pro RNA sestřih mohou způsobovat vážná onemocněním, například mutace zvaná AD29 vedoucí k záměně jediné aminokyseliny v proteinu hPrp31 (tato bílkovina je součástí U4/U6 sestřihového komplexu) je příčinou nemoci retinitis pigmentosa, která často končí úplnou slepotou. Ukázali jsme, že hPrp31 AD29 mutant je nestabilní a není řádně začleněný do sestřihových komplexů. Přesto vadný hPrp31 zřejmě má vliv na metabolismus buňky, protože zpomaluje buněčný růst a dělení, což by mohlo vysvětlit, proč tato mutace vede k retinitis pigmentosa. Dále se zaměřujeme na roli buněčného jádra v pre-mRNA sestřihu. Nové U4/U6·U5 snRNP částice jsou přednostně skládány v nemembránových jaderných strukturách - Cajalových tělíscích. Zjistili jsme, že Cajalova tělíska jsou také důležitá pro recyklaci U4/U6·U5 snRNP. Vedle toho jsme se zaměřili na roli chromatinu (především acetylace histonů) při regulaci alternativního sestřihu. Pomocí inhibitorů histonových deacetylázy jsme změnili...
|
|
|
Formování sestřihových snRNP v buněčném jádře
Novotný, Ivan ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Cmarko, Dušan (oponent) ; Forstová, Jitka (oponent)
1 ABSTRAKT V eukaryotickém buněčném jádře existuje mnoho struktur, suborganel a tělísek. Tyto struktury poskytují jádru mnoho specifických funkcí. Jadérko se specializuje na skládání ribozomů, jaderné "speckles" nebo též SFC, hrají důležitou roli v úpravách RNA a nejlépe prostudovaná jaderná tělíska, Cajalova tělíska (CB), jsou zapojená do maturace snRNP částic. Bezmembránové kompartmenty nejsou unikátní jen pro buněčné jádro, cytoplasmatická tělíska zvaná P bodies jsou pravděpodobně důležitými místy v dráze degradace mRNA. Tato práce je souborem čtyř projektů zaměřených na bezmembránové buněčné struktury, jmenovitě jaderné CB a cytoplasmatické P bodies. Oba druhy buněčných struktur, CB i P bodies, jsou dynamické struktury, které stále vyměňují své součásti se svým okolím. CB je obecně akceptováno jako místo biogeneze snRNP. My jsme ukázali, že v CB jsou snRNP také regenerovány po sestřihu. CB tedy hraje důležitou roli v recyklaci snRNP částic. Kombinací kinetických experimentů a matematického modelování jsme vytvořili kinetický model formování tri-snRNP komplexu v CB na základě kterého jsme určili kinetické parametry skládání tri-snRNP. Podle našeho modelu se v CB skládá tri- snRNP 11x efektivněji než v nukleoplasmě. Identifikovali jsme specifický faktor pro cílení a lokalizaci tri-snRNP komponent do CB....
|
|
|
Replikace a transkripce nukleolární DNA
Flusser, Michal ; Smirnov, Evgeny (vedoucí práce) ; Staněk, David (oponent)
Jadérko je nejvýznamnější částí buněčného jádra a je místem, kde je ribosomální RNA (rRNA) syntetizována, zpracovávána a spojena s ribosomálními proteiny. Přestože bylo jadérko studováno po mnoha desetiletí, je jeho strukturální a funkční organizace stále nejasná. Například, není známa role různých typů DNA, které se účastní tvorby jadérek společně s ribosomálními geny. Tato práce shrnuje dosavadní poznatky a názory týkající se jadérka, se zaměřením na dva syntetické procesy, a to replikaci a transkripci v savčích buňkách. Specifické rysy těchto procesů v souvislosti s nukleolární ultrastrukturou zůstávají nevyřešeným problémem moderní molekulární biologie.
|
|
|
Faktory důležité pro formování Cajalova tělíska
Roithová, Adriana ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Valentová, Anna (oponent)
Tato re er e popisuje strukturu a funkci jaderných domén nazývajících se Cajalova t líska (CB). CB obsahují proteiny a faktory, které se ú astní uspo ádání a modifikace snRNP. Tyto t líska se nachází u obratlovc i bezobratlých a nejdeme je i v rostlinách. Ne v echny typy bun k v ak obsahují CB. Jejich po et a velikost se odvíjí od transkrip ní aktivity bu ky a fázi bun ného cyklu. Tato práce pojednává o faktorech, které mají vliv na formaci CB. Jeden z nejd le it j ích faktor je hladina snRNP a transkrip ní aktivita. V poslední dob se v ak ukazuje, e významnou roli ve formaci CB má i fosforylace coilinu a jiných komponent. Jiné studie ukazují na vliv okolního prost edí. Také se zde diskutuje regulace biogeneze CB, která není je t zcela objasn na. Klí ová slova: Cajalovo t lísko, coilin, bun né jádro, snRNP, pre-mRNA sest ih, transkripce
|
|
|
The role of acetylation in the RNA recognition motif of SRSF5 protein
Icha, Jaroslav ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Šenigl, Filip (oponent)
Acetylace je významná posttranslační modifikace, která byla nalezena u několika tisíc proteinů jak u eukaryot, tak u prokaryot. Globální proteomické studie odhalily, že acetylace reguluje mnoho procesů např. metabolizmus, genovou expresi, buněčný cyklus, stárnutí a mnohé další. V této práci jsem studoval roli acetylace sestřihového faktoru SRSF5 pomocí mutací v jeho acetylačním místě. Testoval jsem hypotézu, že acetylace ovlivňuje vazbu SRSF5 na RNA. V HeLa buňkách jsem exprimoval mutované proteiny SRSF5, jednak mutanta napodobujícího acetylovanou formu (Q) a také neacetylovatelného mutanta (R) a zjišťoval jsem jejich interakci s RNA pomocí RNA imunoprecipitace a také in vitro měřením fluorescenční anizotropie. Výsledky obou metod se shodly na tom, že oba mutanty interagují s RNA méně než přirozená forma proteinu a Q mutant se vázal na RNA slaběji než R mutant. Mutanty se naopak od přirozené formy SRSF5 nelišily v lokalizaci a dynamice v buňce. Rozdíly ve vazbě na RNA byly pravděpodobně překryty dalšími faktory, které ovlivňují chování SRSF5, nejspíše protein-proteinovými interakcemi. Mutantní SRSF5 také neměly dominantní efekt na sestřih alternativního EDB exonu fibronektinu. Získané výsledky poskytují nepřímý důkaz pro hypotézu, že acetylace má vliv na vazbu SRSF5 na RNA. Mutant napodobující acetylovanou...
|
|
|
Struktura a vlastnosti mutanty hPrp31 v Retinitis pigmentosa
Těšina, Petr ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Lišková, Petra (oponent)
Retinitis pigmentosa je dědičné onemocnění, které způsobuje postupné odumírání světločivných buněk a pigmentového epitelu sítnice oka v degenerativním procesu, který představuje jednu z nejčastějších příčin poškození zraku a slepoty. Jde o geneticky velice heterogenní nemoc. Geny, jejichž mutace ji způsobují, jsou většinou exprimovány pouze v buňkách fotoreceptorů. Výjimkou jsou čtyři geny kódující sestřihové faktory účastnící se pre-mRNA sestřihu, které jsou nezbytné pro přežití všech transkripčně aktivních buněk lidského těla. Je proto překvapivé, že mutantní formy těchto proteinů způsobují onemocnění postihující specificky fotoreceptory. Jedním z těchto sestřihových faktorů je i hPrp31, jehož mutantní forma označovaná jako AD29 je hlavním předmětem této práce. Některé účinky této mutace na buněčné úrovni byly nedávno publikovány. V této práci je prezentována tvorba expresního vektoru, exprese a purifikace úseku AD29 mutantní formy proteinu hPrp31. Purifikovaný produkt byl použit k produkci polyklonální králičí protilátky, jejíž použití pro imunofluorescenční značení a western blot bylo úspěšně testováno. Dále je ukázáno objevení nového účinku AD29 mutace, který je zřejmě zodpovědný za některé její negativní projevy na buněčné úrovni, a srovnání struktur úseků 78-333 wild-type a AD29 forem pomocí...
|
|
| |
|
|
Regulace alternativniho sestřihu
Dušková, Eva ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Trejbalová, Kateřina (oponent)
Alternativní sestřih pre-mRNA je důležitým buněčným mechanismem, který umožňuje produkci velkého množství proteinových isoforem z omezeného množství genů. Na regulaci sestřihu alternativních exonů se podílí cis-elementy na pre-mRNA a trans-vazebné faktory (SR a hnRNP proteiny). Vzhledem k tomu, že sestřih probíhá během transkripce, začíná se uvažovat o možné roli struktury chromatinu v regulaci alternativního sestřihu. V této diplomové práci jsme studovali vliv histonové acetylace na alternativní sestřih. Na bázi alternativního exonu EDB, který se nachází ve fibronektinovém genu, jsme vytvořili sestřihový reportér. Ukázali jsme, že inhibice histonových deacetyláz ovlivňuje alternativní sestřih EDB exonu z reportéru stejně jako sestřih endogenního exonu. Dále jsme ukázali, že struktura promotoru má vliv na sestřih alternativního EDB exonu z sestřihového reportéru. Zároveň jsme zjistili, že struktura promotoru ovlivňuje míru acetylace histonu H4 na reportérech. Vkládání EDB exonu do mRNA bylo nepřímo úměrné histonové acetylaci reportéru. Tyto výsledky by mohly vysvětlit proč odlišné promotory mají různé sestřihové poměry alternativních exonů.
|
host ::
RSS.