|
|
Generation and Characterization of Glutamate Carboxypeptidase II (GCPII)-Deficient Mice
Vorlová, Barbora ; Šácha, Pavel (vedoucí práce) ; Eckschlager, Tomáš (oponent) ; Bařinka, Cyril (oponent)
Glutamátkarboxypeptidasa II (GCPII) je transmembránový glykoprotein skládající se z krátké intracelulární a transmembránové domény a velké extracelulární domény, která vykazuje karboxypeptidasovou aktivitu. GCPII se podílí na neuromodulaci v mozku a absorpci folátů v tenkém střevě. Kromě těchto tkání se GCPII též vyskytuje v prostatě a ledvinách. Zde je ale její role neznámá. Za účelem zjištění funkce GCPII se několik vědeckých skupin pokusilo inaktivovat gen Folh1 (kódující GCPII) v myši. Tyto experimenty však vedly k rozporuplným výsledkům. Zatímco dvě studie ukázaly, že inaktivace genu Folh1 v myši vede k embryonální letalitě, jiné dvě studie publikovaly, že i po zmíněné inaktivaci jsou myši stále viabilní a navíc nevykazují žádný výrazný fenotyp. Cílem tohoto projektu bylo pokusit se připravit a charakterizovat myši s inaktivovaným Folh1 genem pomocí alternativní metody genetické modifikace. Za tímto účelem byly vytvořeny TALENy, které specificky cílily 11. exon genu Folh1 v myších zygotách genetického pozadí C57BL/6NCrl. Narozená mláďata generace F0 byla analyzována pro přítomnost mutací v rámci genu Folh1 a myši, které dohromady nesly 5 různých delecí, byly vybrány pro vytvoření mutantních linií. Linie, které nesly mutantní varianty genu Folh1 na obou alelách, neobsahovaly detekovatelnou...
|
|
|
Proteolytické systémy krevničky střevní (Schistosoma mansoni).
Fajtová, Pavla ; Horn, Martin (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent) ; Sojka, Daniel (oponent)
Schistosomóza je závažné parazitární onemocnění člověka, jehož původcem jsou krevničky, krevní motolice rodu Schistosoma. Celosvětově je schistosomózou, která představuje globální světový problém, infikováno přes 200 miliónů lidí a dalších 750 miliónů je vystaveno riziku nákazy. Jediný účinný lék pro léčbu schistosomózy je chemoterapeutikum praziquantel, u kterého je riziko vzniku rezistence. Proteasy krevničky představuji nadějné cílové molekuly pro vývoj nových terapeutických strategií proti schistosomóze. Tato práce se zaměřuje na komplexní charakterizaci proteolytických systémů krevničky Schistosoma mansoni a určení jejich role v interakci s hostitelem. Za prvé byly pomocí metod funkční proteomiky popsány hlavní proteolytické aktivity sekretované jednotlivými vývojovými stádii krevničky, která parazitují v těle člověka. Tato analýza prokázala jejich komplexní a specifickou distribuci s převažujícími serinovými a cysteinovými proteasami a metaloproteasami. Za druhé byly pomocí přístupu chemické genomiky identifikovány povrchové a trávicí proteasy krevničky, konkrétně prolyloligopeptidasa a katepsiny typu B, C a D, jako vhodné cílové molekuly pro terapeutickou intervenci. Prolyloligopeptidasa byla biochemicky charakterizována na úrovni rekombinantního proteinu, byly vyvinuty její účinné...
|
|
|
Glutamate Carboxypeptidase II - Structural and Biochemical Characterization and Structure-Assisted Drug Design
Ptáček, Jakub ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Brynda, Jiří (oponent)
Glutamátkarboxypeptidasa II (GCPII) je lidská membránová metalopeptidasa objevená před více než třiceti lety. Od té doby je předmětem zájmu vědců z mnoha odvětví kvůli jejímu výskytu v různých tkáních lidského těla a rozličným biologickým funkcím. Exprese GCPII byla detekována na povrchu astrocytů v centrálním i periferním nervovém systému, kde je zodpovědná za štěpení nejrozšířenějšího lidského peptidového neurotransmiteru N- acetyl-aspartyl glutamátu (NAAG). Jeden z produktů - glutamát - je významným excitačním neurotransmiterem, jehož nadprodukce (takzvaná glutamátová excitotoxicita) je příčinou smrti neuronů v mnoha neurologických poruchách. Tento jev spolu s neuroprotektivní funkcí NAAG vedl ke zjištění, že inhibice GCPII představuje potenciální terapeutický cíl v těchto poruchách. Rakovina prostaty je druhým nejčastějším nádorovým onemocněním u mužů, a přestože je její progrese relativně pomalá, tak velmi často tvoří metastáze ohrožující život. Ve srovnání se zdravou tkání byla na povrchu nádorových buněk prostaty i metastází pozorována zvýšená exprese GCPII a tedy představuje proteinový marker odlišující zdravé buňky prostaty od nádorových. Toto bylo potvrzeno mnoha publikacemi a využito v několika klinických studiích. Další fyziologickou úlohou GCPII je odštěpování glutamátu z...
|
|
|
Regulace aktivity aspartátových a serinových proteas pomocí selektivních přirozených inhibitorů
Srp, Jaroslav ; Mareš, Michael (vedoucí práce) ; Novák, Petr (oponent) ; Bařinka, Cyril (oponent)
Proteasy se účastní řady významných fyziologických procesů a jejich nedostatečná kontrola je spojena s řadou patologií. Přirozené inhibitory představují účinný nástroj pro regulaci jejich aktivity. Disertační práce se zaměřuje na živočišné a rostlinné inhibitory aspartátových a serinových proteas a přináší identifikaci, biochemickou charakterizaci a strukturní popis jejich mechanismu inhibice. Rostlinné inhibitory z Kunitzovy rodiny jsou produkované jako obranné proteiny s unikátní schopností blokovat široké spektrum proteas. V této práci byl s využitím metod funkční proteomiky popsán trávicí proteolytický systém mandelinky bramborové, herbivorního škůdce lilkovitých rostlin. Byl podán přímý důkaz, že trávicí aspartátové a serinové proteasy tohoto herbivora jsou efektivně blokovány pomocí dvou Kunitzových inhibitorů (nazývaných PCDI a PSPI), které jsou produkované v lilku brambor. Pomocí strukturní analýzy byly na molekulách PCDI a PSPI identifikovány nové typy reaktivních center pro inhibici aspartátových proteas typu katepsinu D a serinových proteas typu trypsinu a chymotrypsinu. Popis reaktivního centra na PCDI inhibitoru společně s krystalovou strukturou trávicí proteasy typu katepsinu D mandelinky bramborové umožnilo vysvětlit mechanismus jejich vzájemné interakce. Pro lidský katepsin D byly...
|
|
|
Post-translační modifikace tubulinu
Kropáčková, Veronika ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Dostál, Vojtěch (oponent)
Mikrotubuly složené z heterodimerů αβ-tubulinu jsou nedílnou součástí buněčného cytoskeletu eukaryotických organismů. Podílejí se na transportu, který v buňce probíhá, určují rozmístění membránových organel a utvářejí buněčnou polaritu. Dále jsou součástí dynamických struktur, jako je například dělící vřeténko, ale tvoří také stabilní struktury, jako jsou axonemy bičíků a cilií. Mikrotubuly tedy v buňkách a tkáních zastávají mnoho odlišných funkcí a musí se proto od sebe nějakým způsobem odlišovat. Právě post-translační modifikace molekul αβ-tubulinu v mikrotubulech jsou zdrojem jejich diverzity a definují tzv. "tubulinový kód". Doposud bylo identifikováno dvanáct post-translačních modifikací tubulinu/mikrotubulů. Rozluštění mechanismů, jakými k post-translačním modifikacím tubulinu/mikrotubulů dochází, včetně identifikace odpovědných enzymů, je důležitým zdrojem porozumění dopadu těchto modifikací na biologické funkce. Klíčová slova: tubulin, post-translační modifikace, mikrotubuly, acetylace, tyrosinace, polyaminace, polyglutamylace
|
|
|
Deriváty protilátek využitelné k detekci lidské glutamátkarboxypeptidasy II
Bělousová, Nikola ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Rakovina prostaty je jedním z nejzávažnějších rakovinných onemocnění na světě, a proto je velmi důležitý vývoj vhodných diagnostických a terapeutických postupů. Glutamátkarboxypeptidasa II (GCPII) je v současné době posuzována jako jeden z nejzajímavějších markerů rakoviny prostaty díky své tkáňově specifické expresi. Zatímco ve zdravé tkáni prostaty se vyskytuje mizivé množství tohoto proteinu, spolu se vznikem nádoru se výrazně zvyšuje produkce GCPII v transformovaných buňkách. Množství GCPII v rakovinné tkáni dále stoupá spolu se vzrůstající invazivitou nádoru, proto je GCPII vhodný marker pro časná i pokročilá metastazující stadia rakoviny prostaty. Současný výzkum se zaobírá vývojem látek dostatečně citlivých a specifických pro detekci malého množství GCPII, například v počátečních stadiích rakoviny. Deriváty protilátek se ukazují jako molekuly vhodné pro tento účel, neboť vykazují vysokou afinitu a specificitu a minimální nežádoucí vedlejší účinky. Proteinové inženýrství umožňuje přípravu celé řady protilátkových molekul lišících se svou velikostí, vazebnými vlastnostmi, stabilitou a rozpustností a způsobem produkce. Odlišné deriváty jsou vyvíjeny pro účely diagnostické a terapeutické a pro zobrazovací techniky, pro které jsou vhodné molekuly o střední až malé velikosti. Jedním typem těchto...
|
|
|
Strukturní studie inhibičních mechanismů kinas fosfatidylinositolu.
Gregor, Jiří ; Bouřa, Evžen (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent)
+ssRNA viry po vstupu do buňky tvoří platformy pro svoji replikaci - replikační organely. V těchto oblastech je díky činnosti fosfatidylinositol 4-kinasy zvýšená koncentrace PI4P, který vytváří vhodné prostředí pro vazbu virové polymerasy 3DPOL . Jednou z těchto kinas je PI4KB, která je vázána na membránu prostřednictvím ACBD3 proteinu, který je sám k membráně vázán interakcí s giantinem. Některé kobuviry a enteroviry z čeledi Picornaviridae pomocí nestrukturního proteinu 3A vytěsní ACBD3 protein z vazby s gigantinem a přemístí ho z Golgiho aparátu do replikační organely. Na ACBD3 se zde váže PI4KB a následně katalyzuje vznik PI4P. V Golgiho aparátu byly objeveny pouze dva proteiny - TBC1D22A a TBC1D22B - které se váží do stejného místa ACBD3 proteinu jako PI4KB. Cílem této práce bylo ověřit interakci peptidů z proteinů TBC1D22A a TBC1D22B s ACBD3 proteinem a zjistit sílu této interakce. Dalším cílem bylo vykrystalizovat komplexy těchto interakčních partnerů a následně vyřešit jejich trojrozměrné struktury. Bylo zjištěno, že interakce ACBD3 proteinu s peptidy TBC1D22A a TBC1D22B je mnohem slabší než interakce ACBD3 s PI4KB. Podařilo se připravit krystaly komplexu ACBD3 s TBC1D22A, ale bohužel difraktovaly jen k velmi nízkému rozlišení, a tudíž struktura nemohla být vyřešena.
|
|
|
Zinc-Dependent Hydrolases: Structure-Function Study of Glutamate Carboxypeptidase II and Histone Deacetylase 6
Škultétyová, Ľubica ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Novák, Petr (oponent)
Proteiny vázající zinek představují přibližně desetinu proteomu a významnou část z nich tvoří hydrolasy závislé na zinku. Tato disertační práce se zaměřuje na biochemickou a strukturní charakterizaci glutamátkarboxypeptidasy II (GCPII) a histondeacetylasy 6 (HDAC6), které jsou členy rodiny metalohydrolas závislých na zinku, a popisuje interakce s jejich přirozenými substráty a inhibitory. GCPII je homodimerní membránová proteasa, která v centrální a periferní nervové soustavě katalyzuje odštěpení glutamátu z neuropřenašeče N-acetyl-aspartyl glutamátu (NAAG) a v tenkém střevě z folátů přijatých v potravě. Tento enzym je spojován s několika neurologickými poruchami a představuje také ideální cíl pro diagnostiku a léčbu rakoviny prostaty. Inhibitory GCPII obvykle nesou skupinu vázající zinek a dále obsahují funkční skupinu specificky rozpoznávanou v S1' místě enzymu (tvořenou glutamátovým zbytkem nebo jeho isosterem). Tyto sloučeniny jsou přirozeně hydrofilní molekuly, což brání jejich průniku přes hematoencefalickou bariéru a znemožňuje inhibici GCPII v centrální nervové soustavě. V této disertační práci představujeme různé strategie zaměřené na záměnu tradičního P1' glutamátového zbytku nevětvenými neproteinogenními aminokyselinami a bioisostery glutamátu. Dále pak sledujeme vliv zavedení...
|
|
|
Vliv palmitoylace na biologické funkce proteinů
Frýdová, Tereza ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Palmitoylace je lipidická post-translační modifikace proteinů, která se řadí mezi nejrozšířenější lipidické modifikace v eukaryotických buňkách. Na rozdíl od ostatních lipidických post-translačních modifikací je tato modifikace reverzibilní a umožňuje tak časově-prostorovou regulaci, která probíhá obdobným způsobem jako u fosforylace či ubikvitinace. Palmitoylace pak sama reguluje interakce cytosolických proteinů s membránovými doménami, zároveň hraje důležitou roli v intracelulárním přenosu a ovlivňuje konformaci a stabilitu proteinů. Patofyziologický průběh palmitoylace je spojen s několika neurodegenerativními onemocněními, jako je například Alzheimerova choroba či neuronální ceroidní lipofuscinóza. Klíčová slova: palmitoylace, depalmitoylace, post-translační modifikace, DHHC proteinová doména, lipidická modifikace
|
|
|
Vliv iontu Ca2+ na aktivitu lidské glutamátkarboxypeptidasy II.
Nedvědová, Jana ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Hlouchová, Klára (oponent)
Lidská glutamátkarboxypeptidasa II (GCPII, EC 3.4.17.24) je homodimerní membránový glykoprotein, který slouží jako marker rakoviny prostaty a rovněž jako terapeutický cíl léčby neurodegenerativních onemocnění. Extracelulární část GCPII je složená z apikální, proteasové a C-koncové domény. V aktivním místě jsou přítomny dva zinečnaté ionty nezbytné pro enzymatickou aktivitu. V blízkosti dimerizačního rozhraní je pak mezi apikální a proteasovou doménou koordinován ion Ca2+ , který je od aktivního místa vzdálen 20 Å, a tudíž se pravděpodobně přímo neúčastní hydrolýzy substrátů. Předkládaná práce si klade za cíl objasnit funkci iontu Ca2+ v molekule GCPII s využitím kombinace molekulárně- biologických, biochemických a biofyzikálních přístupů. Za tímto účelem jsme připravili sérii rekombinantních proteinů s bodovými mutacemi aminokyselin koordinujících Ca2+ ion. Mutantní proteiny byly exprimovány v hmyzích S2 buňkách a purifikovány pomocí afinitní a gelové permeační chromatografie. Tyto proteiny vykazovaly výrazně sníženou enzymatickou aktivitu, nižší teplotní stabilitu a zvýšenou tendenci k tvorbě nefyziologických agregátů a naopak monomerní formy GCPII. Z výsledků tedy vyplývá, že ion Ca2+ hraje zásadní roli pro správné sbalování GCPII a rovněž pro tvorbu homodimerů, které jsou fyziologickou a hydrolyticky...
|
host ::
RSS.