|
|
Produkce auxinového transportéru PIN1 v HEK293 buněčné linii
Petermannová, Romana ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Hýsková, Veronika (oponent)
Protein PIN1 patří do rodiny transportérů PIN. Tato skupina transportérů se významně podílí na přenosu auxinu vně z buňky. Přenos auxinu mezi rostlinnými buňkami hraje důležitou roli v růstu rostliny, gravitropismu, apod. Princip transportu auxinu tímto přenašečem není dosud příliš prozkoumaný. Tato práce se zabývá produkcí transportéru PIN1 pomocí rekombinantní exprese proteinů v lidských embryonálních ledvinných buňkách 293. Produkce v těchto buňkách byla ověřena pomocí akumulace radioaktivního auxinu a imunofluorescence.
|
|
|
Proteázy folikulárních tekutin skotu
Drahokoupil, Marek ; Liberda, Jiří (vedoucí práce) ; Hýsková, Veronika (oponent)
Tato bakalářská práce se zabývá izolací a částečnou charakterizací proteáz folikulární tekutiny krávy. Folikulární tekutina byla nejprve rozdělena podle molekulových hmotností pomocí gelové chromatografie na Sephadexu G-100. Jako další metoda izolace byla zvolena ionexová chromatografie na Sephadexu DEAE. S výslednými frakcemi byla provedena SDS elektroforéza, stanovení proteolytické aktivity s proteolytickým substrátem azakaseinem; zymografie a diferenční SDS elektroforézy. Sebrané frakce folikulární tekutiny, stanovené metodou gelové chromatografie, měly relativní molekulové hmotnosti v rozmezí: 114 000 - 131 000 pro vzorek frakce I; 44 000 - 51 000 pro vzorek frakce II; 151 000 - 204 000 pro vzorek frakce III; 57 000 - 99 000 pro vzorek frakce IV; 14 000 - 38 000 pro vzorek frakce V; 180 - 500 pro vzorek frakce VI. Z výsledků proteolytické aktivity bylo rozhodnuto, že se nadále bude pracovat jen se vzorky frakcí III, IV a V, sebraných z gelové chromatografie a se vzorkem opožděné frakce PBS II, sebrané z ionexové chromatografie. Tyto vzorky vykazovaly nejvyšší aktivitu. Byly použity inhibitory, jimiž bylo možné určit, které typy proteáz se vyskytují ve vybraných frakcích. Ve frakci III, sebrané z gelové chromatografie, se vyskytovaly aspartátové proteázy, metalloproteázy a serinové proteázy,...
|
|
|
Antioxidační vlastnosti léčivých rostlin
Tupec, Michal ; Hýsková, Veronika (vedoucí práce) ; Poljaková, Jitka (oponent)
U rostlin se během evoluce vyvinuly velmi účinné mechanizmy likvidace škodlivých sloučenin, mezi něž se řádí např. reaktivní formy kyslíku (ROS). Tyto mechanizmy jsou založeny převážně na antioxidačních účincích kyseliny askorbové a glutathionu v úzké kooperaci se superoxiddismutasou, katalasou a rozličnými peroxidasami - velkou roli při eliminaci ROS rovněž hrají redukované koenzymy NADH a NADPH. V poslední době se však pozornost obrací od těchto klíčových sloučenin primárního metabolizmu k sekundárním metabolitům. Fenolické sloučeniny společně s některými terpeny a alkaloidy podle všeho také vykazují antioxidační účinky a zřejmě hrají v ži- votě rostliny nezastupitelnou úlohu - kromě antioxidačního působení jsou důležité také v boji proti patogenům a býložravcům, při lákání opylovačů nebo zmírňování účinků UV záření. Přírodní látky jsou zkoumány také ve vztahu k člověku - je známa celá řada účinků a mezi ty nejčastější patří antioxidační, protizánětlivé a protirakovinné. V rámci této práce byly získány extrakty převážně nízkomolekulárních látek ze 32 rostlin pomocí horké vody, 80%w vodného roztoku methanolu či prostým odšťav- něním. Extrakty byly podrobeny třem standardním testům antioxidační aktivity: dvěma stanovením antioxidační kapacity vztažené na ekvivalenty troloxu (TEAC) a stanovení...
|
|
|
Ekonomický aspekt vyšetřování funkce štítné žlázy
Stehlíková, Petra ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Hýsková, Veronika (oponent)
V roce 2011 bylo vydáno Doporučení pro laboratorní diagnostiku funkčních a autoimunitních onemocnění štítné žlázy, jehož cílem je doporučit praktickým lékařům správný postup při výběru parametrů pro vyšetřování funkce štítné žlázy a najít tak způsob, jak ušetřit peníze na zbytečných vyšetřeních, které by nemocnice mohly využít v jiné oblasti. K ověření, zda lékaři dodržují tato doporučení, byl použit soubor pacientů VFN v Praze získaný za rok 2011, který byl statisticky vyhodnocen. Sledovanými parametry byly tyreotropin (TSH), volný trijódtyronin (FT3), celkový trijódtyronin (T3), volný tyroxin (FT4), celkový tyroxin (T4), protilátky proti tyreiodální peroxidáze (anti - TPO), protilátky proti tyreoglobulinu (anti - Tg), tyreoglobulin (Tg) a tyroxin vážící globulin (TBG), z nichž základní testem by měl být podle doporučení TSH a při jeho hodnotách mimo referenční meze pak má následovat test FT4, případně stanovení protilátek. Další parametry jsou pro prvotní vyšetření nadbytečné, některé se dnes již nepoužívají nebo by je měly vyšetřovat pouze kliniky specializované v oblasti endokrinologie. Bylo zjištěno, že mnoho lékařů tato zbytečná vyšetření stále objednává. Jen za jeden rok bylo provedeno při vyšetřování funkce štítné žlázy 13,8 % nadbytečných stanovení parametrů z celkového počtu 44 415 vyšetření, v...
|
|
|
Vliv abiotického stresu na metabolismus rostlin okurky (Cucumis sativa L.)
Plisková, Veronika ; Hýsková, Veronika (vedoucí práce) ; Müller, Karel (oponent)
V důsledku působení vysoké koncentrace soli dochází k akumulaci sodných iontů v rostlině, což způsobuje neschopnost přijímat vodu, narušení rovnováhy iontů, poškození fotosyntézy a vznik oxidativního stresu. V souvislosti se solným stresem tedy klesá dostupnost NADPH. Odolnost rostliny vystavené působení zvýšené koncentrace soli závisí na její schopnosti kompenzovat sníženou dostupnost NADPH, jenž může být využit jako koenzym v antioxidačních řetězcích a k syntéze antioxidačních a osmoticky aktivních látek. V této práci bylo u rostlin okurky seté (Cucumis sativa L. convar. Jogger F1) vystavených solnému stresu v podobě 100 mM NaCl zaznamenáno snížení relativního obsahu vody, snížení množství enzymu Rubisco a zvýšení množství proteinu Hsp70 v listech a zvýšení akumulace sodných iontů v listech i kořenech. Následkem solného stresu došlo ke zvýšení aktivity (až o 270 %) enzymů poskytujících NADPH: NADP- dependentní isocitrátdehydrogenasy , glukosa-6-fosfátdehydrogenasy, NADP-dependentní malátdehydrogenasy (oxalacetát dekarboxylační), nefosforylační glyceraldehydfosfátdehydrogenasy v listech experimentálních rostlin, a to hlavně druhý a třetí den působení solného stresu. Také aktivita méně zastoupených NADP-dependentních enzymů (až o 200 %) : glukosa-1-dehydrogenasy, glukonát-2-dehydrogenasy,...
|
|
|
Oxidace ellipticinu lidskými cytochromy P450 exprimovanými v prokaryotním a eukaryotním systému
Vejvodová, Lucie ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Hýsková, Veronika (oponent)
Ellipticin, protinádorový alkaloid, představuje léčivo, jehož mechanismus účinku je založen na interkalaci do DNA, inhibici topoisomerasy II a na tvorbě kovalentních aduktů s DNA prostřednictvím enzymové aktivace cytochromy P450 a/nebo peroxidasami. Ellipticin je oxidován cytochromy P450 až na pět metabolitů (7-hydroxy-, 9-hydroxy-, 12-hydroxy-, 13- hydroxyellipticin a N2 -oxid ellipticinu). Z těchto metabolitů jsou 9-hydroxy- a 7- hydroxyellipticin považovány za detoxikační metabolity, zatímco 12-hydroxyellipticin, 13- hydroxyellipticin a N2 -oxid ellipticinu za aktivační metabolity, které jsou zodpovědné za tvorbu kovalentních aduktů s DNA. V diplomové práci byla testována efektivita lidských rekombinantních cytochromů P450 exprimovaných v eukaryotním (SupersomesTM ) a dvou prokaryotních expresních systémech (Bactosomes) v oxidaci ellipticinu. Cytochromy P450 exprimované v prokaryotních systémech se lišily v množství "koexprimované" NADPH:CYP reduktasy. Vzniklé metabolity ellipticinu byly analyzovány metodou HPLC. Výsledky získané v diplomové práci demonstrují, že lidské cytochromy P450 CYP2C9/2D6/2C19 exprimované v prokaryotním nebo eukaryotním systému oxidují ellipticin za vzniku až čtyř metabolitů: 9-hydroxy-, 12-hydroxy-, 13-hydroxyellipticinu and N2 -oxid ellipticinu. Jejich účinnost se ale...
|
|
|
Agregace proteinů býčí semenné plasmy
Boháček, Hanuš ; Liberda, Jiří (vedoucí práce) ; Hýsková, Veronika (oponent)
Savčí fertilizace je jedinečný a fascinující sled událostí, v němž se významně uplatňují seminální proteiny. Je známo, že v případě býka (Bos taurus) se proteiny semenné plazmy (BSP), zvláště pak jejich majoritní složka PDC-109, nacházejí v agregovaných stavech, ale o mechanismu tvorby agregátů a jejich biologické funkci se příliš mnoho neví. Z výsledků této práce vyplývají některé zajímavé vlastnosti PDC-109 a BSP. Zjistili jsme, že koncentrace těchto proteinů má značný vliv na jejich agregaci, což může mít důležitý biologický význam. Separace seminálních proteinů gelovou chromatografií odhalila existenci tří hlavních frakcí, označených I, II a III, odpovídajících relativním molekulovým hmotnostem Mr > 150 000, Mr = 30 000 a Mr = 13 000, resp. Jejich molekulové hmotnosti jsou zachovány i po purifikační proceduře v případě PDC-109, což naznačuje velmi stabilní interakce, zahrnuté ve formaci agregátů. Navíc byla v jednotlivých frakcích rozdílná distribuce glykoforem PDC-109, jež může souviset s jejich odlišným vazebným chováním k membráně spermie, což jsme zjistili pomocí fluorescenční mikroskopie. Nicméně k lepšímu pochopení studované problematiky je zapotřebí dalších experimentů.
|
|
|
Studie mechanismu tvorby fibrinové sítě
Božíková, Paulína ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Hýsková, Veronika (oponent)
Serinová proteasa trombin hraje důležitou roli v procesu vzniku fibrinové sítě, kdy katalytickým účinkem přeměňuje molekuly fibrinogenu na fibrin monomer, který spontánně polymeruje za vzniku fibrinové sítě. Cílem této práce byla charakterizace interakcí mezi trombinem a povrchově vázaným fibrin(ogen)em nebo fibrinovou sítí, na které se trombin může vázat a tím podpořit nárůst sítě. Aktivita trombinu navázaného na fibrin nebo fibrinovou síť byla určena spektrofotometricky v závislosti na množství štěpeného chromogenního substrátu. S využitím metody resonance povrchových plasmonů byl pozorován vznik fibrinové sítě iniciovaný trombinem vázaným na fibrinogen nebo fibrin. Takto vzniklé sítě byly zobrazeny mikroskopem atomárních sil. Afinitní konstanta KD určena pro interakci fibrinogenu v roztoku s fibrinovou sítí připravenou na povrchu je ve shodě s dřívějším experimentem, ve kterém byla KD stanovena z interakce fibrinogenu, kovalentně vázaného na povrch, s monomery fibrinu v roztoku.
|
|
|
Vliv teplotních změn na aktivitu různých enzymů v rostlinách.
Doričová, Vlasta ; Hýsková, Veronika (vedoucí práce) ; Liberda, Jiří (oponent)
Teplotní stres je jedním z abiotických stresových faktorů, který podstatným způsobem ovlivňuje růst a vývoj rostlin. Rostliny odpovídají na teplotní stres řadou buněčných a metabolických změn, charakteristická je syntéza molekulárních chaperonů tzv. heat-shock proteinů (HSP). V této práci byl studován vliv teplotního šoku (v podobě působení 40řC 1 hodinu z 20řC) na aktivity NADP-dependentních enzymů, enzymů Hatchova-Slackova cyklu, glykosidas a na aktivitu peroxidasy v listech tabáku (Nicotiana tabacum L. cv. Petit Havana SR1). Vzhledem k tomu, že HSP napomáhají správnému sbalování nezralých proteinů, podílejí se na opravování špatně sbalených nebo částečně denaturovaných proteinů, na degradaci denaturovaných proteinů a na vytvoření termotolerance rostliny, bylo cílem práce zjistit, zda aktivita studovaných enzymů zůstane zachována, nebo zda bude modulována v rámci obranné odpovědi. Největší množství proteinu HSP70 detekované imunochemicky bylo zjištěno 1 hodinu po aplikaci teplotního šoku kdy byly také stanoveny vyšší aktivity šikimátdehydrogenasy, NADP-dependentní malátdehydrogenasy (oxalacetát-dekarboxylační), fosfoenolpyruvát- karboxylasy, β-hexosaminidasy a α-mannosidasy, než v kontrolních rostlinách, které vyšší teplotě vystaveny nebyly. Aktivita peroxidasy byla oproti kontrolním rostlinám...
|
|
|
Výzkum Struktury β-N-Acetylhexosaminidasy z Penicillium oxalicum.
Krunclová, Tereza ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Hýsková, Veronika (oponent)
v češtině β-N-Acetylhexosaminidasa (EC 3.2.1.52) je exoglykosidasa, která má ve vláknitých houbách unikátní vlastnosti. Enzym z těchto organismů je dimerní, inducibilní a extraceluárně sekretovaný. Je exprimovaný jako preproprotein, skládá se ze signální sekvence, dlouhého propeptidu a katalytické podjednotky. Ačkoli je enzym široce rozšířen, jeho struktura se v jednotlivých organismech liší. Bakterie mají hexosaminidasy pouze monomerní. Lidské enzymy jsou stejně jako fungální dimerní, ale jen hexosaminidasy z vláknitých hub mají katalytickou podjednotku asociovanou nekovalentně s propeptidem. Propeptid je nezbytnou součástí aktivního enzymu. Existuje homologní model katalytické podjednotky β-N-acetylhexosaminidasy z Penicillium oxalicum, ale struktura propeptidu zatím vyřešená nebyla. Tato diplomová práce se v první části zabývá optimalizací podmínek produkce a purifikace. V druhé části se zabývá strukturními studiemi β-N-acetylhexosaminidasy z vláknité houby Penicillium oxalicum CCF 3438. Tyto studie byly prováděny pomocí metod chemického sítění a hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením. Kombinací těchto metod byla odhalena místa nekovalentní interakce katalytické podjednotky a propeptidu. (In Czech)
|
host ::
RSS.