|
|
Úprava vzorku pro stanovení alfa-tokoferolu v erytrocytární membráně vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií
Denková, Barbora ; Šatínský, Dalibor (oponent) ; Solich, Petr (vedoucí práce)
V této rigorózní práci byla vyvinuta nová metoda umožňující izolaci α-tokoferolu z membrán lidských erytrocytů pro následné stanovení tohoto vitaminu vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) s využitím ultracentrifugace a extrakce na tuhou fázi (SPE). Právě SPE je dnes jedna z nejúčinnějších a nejspolehlivějších moderních metod umožňujících vhodnou úpravu vzorku biologického materiálu před chromatografickou analýzou. Vyvinutý postup SPE je následující: 1) Promytí odebraných erytrocytů: 2,5 ml nesrážlivé krve centrifugujeme 10 min při 1300×g, 4˚C a horní vrstvu plasmy oddělíme. K erytrocytům přidáme roztok 0,01% BHT ve fyziologickém roztoku do objemu 2,5 ml a centrifugaci zopakujeme. Odstraníme supernatant a celý postup opakujeme třikrát. Promyté erytrocyty skladujeme při teplotě -86˚C. 2) Vlastní extrakce α-tokoferolu z promytých erytrocytů: Do ultracentrifugační kyvety napipetujeme 500 μl 50 mmol/l roztoku D-mannitolu a 500 μl 5 mmol/l HEPESu. Poté odebereme 100 μl rozmražených promytých erytrocytů pomocí pístové pipety, pipetu zvenku pečlivě otřeme buničinou a erytrocyty vpravíme do kyvety. Následně přidáme 11 μl 1 mol/l roztoku CaCl2 a vzorek ultracentrifugujeme 3 minuty, při 90 000 rpm (288 000×g, rAV = 31,8 mm) a 4žC. Po vyjmutí vzorku z ultracentrifugy odpipetujeme 500 μl supernatantu...
|
|
|
HPLC stanovení luteinu, zeaxanthinu a betakarotenu v potravních doplňcích
Dvořáková, Petra ; Šatínský, Dalibor (vedoucí práce) ; Chocholoušová Havlíková, Lucie (oponent)
Tato rigorózní práce se zabývá úpravou metody separace karotenoidů luteinu, betakarotenu a zeaxanthinu převzaté z diplomové práce (Optimalizace chromatografických podmínek pro HPLC stanovení vybraných karotenoidů, Petra Dvořáková, 2009). Základní metodou je HPLC s VIS detekcí. Úprava spočívala ve vyvinutí gradientové eluce pro zkrácení doby analýzy. Při optimalizaci postupu gradientové eluce byly testovány čtyři způsoby. Druhým úkolem této rigorózní práce je shrnutí extrakčních způsobů pro vybrané karotenoidy, které byly publikovány v odborné literatuře a navržení způsobů extrakce vhodných pro izolaci karotenoidů z potravních doplňků. Při hledání optimálního způsobu extrakce byla využívána extrakce organickými rozpouštědly. Zkoušena byla jak prostá extrakce do organického rozpouštědla, tak extrakce s předchozí úpravou vzorku saponifikací nebo okyselením extrakčního prostředí. Přes vyzkoušení celé řady postupů a organických rozpouštědel se nepodařilo nalézt optimální a univerzální způsob extrakce karotenoidů z lékových forem.
|
|
|
Aplikace SPE a technologie monolitních kolon v HPLC analýze biologicky aktivních látek
Horčičková, Šárka ; Šatínský, Dalibor (oponent) ; Solich, Petr (vedoucí práce)
Extrakce na pevnou fázi (SPE) představuje účinnou, spolehlivou a selektivní moderní metodu pro úpravu vzorku biologického materiálu před chromatografickou analýzou. V diplomové práci byla vyvinuta nová metoda SPE pro izolaci vitaminu D2 (ergokalciferol), D3 (cholekalciferol) a metabolitu 25-(OH)D3 (kalcidiol) z lidského séra současně s vitaminy A (retinol) a E ( - tokoferol). Jednotlivé vitaminy byly následně stanoveny již vyvinutou a validovanou metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). Vyvinutý postup SPE: Do skleněné zkumavky napipetujeme 250 l séra a přidáme 1000 l ethanolu o teplotě 4řC. Vzorek protřepeme a necháme 10 minut deproteinovat v chladničce při teplotě 4řC, poté zcentrifugujeme (4 000 x g, 15 minut, 4řC). Opatrně odebereme supernatant a naneseme na předem připravenou SPE kolonku (promytí 1 ml methanolu následně 1 ml destilované vody). Během těchto dvou kroků nesmí dojít k vyschnutí sorbentu kolonky. Vitamíny eluujeme 1,5 ml methanolu a následně 2 ml hexanu. Eluát odpaříme v koncentrátoru při teplotě 45řC. Odparek rozpustíme v 250 l methanolu a analyzujeme již vyvinutou HPLC metodou. Optimalizovaná HPLC metoda: Mobilní fáze - A: methanol:voda:2-propanol (75:15:10) 3,0 ml/min, 0.-3. minuta, B: methanol:voda (95:5) 3,5 ml/min, 3.- 6,5. minuta; kolona - monolitní kolona...
|
|
|
HPLC separace p-aminofenolu, paracetamolu, kofeinu a propyfenazovu na polární stacionární fázi
Maroušková, Alena ; Sklenářová, Hana (oponent) ; Šatínský, Dalibor (vedoucí práce)
V této práci byly nalezeny optimální chromatografické podmínky pro separaci p-aminofenolu, paracetamolu, kofeinu a propyfenazonu pomocí metody HPLC. Jde o látky vzájemně se lišící lipofilitou a acidobazickými vlastnostmi. Použití klasických kolon s reverzní fází je pro jejich společné stanovení problematické. PEG kolona se ukázala jako vhodná pro efektivní separaci látek s odlišnou polaritou, tedy s různým chromatografickým chováním. Výhodou výsledné metody je především zkrácení doby analýzy, což hraje významnou roli zejména při analýzách velkých sérií vzorků. V rámci optimalizace chromatografických podmínek: byl vyzkoušen široký výběr mobilních fází (různá organická rozpouštědla, různý poměr zastoupení organické složky ke složce vodné) bylo testováno pH mobilní fáze v rozmezí 4 - 7 byly testovány různé pufry bylo vyzkoušeno chování látek na koloně při zvýšené teplotě byly testovány dvě PEG kolony s rozdílnými délkami Byly nalezeny optimální chromatografické podmínky, při kterých dojde k separaci výše uvedených látek a které současně vyhovují požadavkům na jednoduchost a časovou nenáročnost při zachování vysoké spolehlivosti metody. Konečné chromatografické podmínky: Stacionární fáze: Supelco Discovery HS PEG kolona (15 x 4 mm, 3 µm) Mobilní fáze: octanový pufr o pH 4,5 s obsahem 0,04%...
|
|
|
Optimalizace podmínek pro kvalitativní a kvantitativní analýzu farnesolu a tyrosolu pomocí UPLC-MS/MS.
Greguš, Petr ; Šatínský, Dalibor (oponent) ; Nováková, Lucie (vedoucí práce)
VYUŽITÍ TECHNIKY UHPLC/MS/MS PRO KVALITATIVNÍ A KVANTITATIVNÍ ANALÝZU FARNESOLU A TYROSOLU, JAKO PRODUKTŮ METABOLISMU KVASINKY CANDIDA ALBICANS Petr Greguš 1 , Lucie Nováková 1 1 Universita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Heyrovského 1203, 50005 Hradec Králové ABSTRAKT : Candida albicans je obecně jedna z nejčastěji izolovaných houbovitých patogenů v lidském těle. Je obecný původce nosokomiálních nákaz, infekcí krevního oběhu, urinárních infekcí a infekcí zažívacího traktu. Jedno z nejčastějších infekčních onemocnění je vulvovaginální kandidóza, která postihuje většinu zdravé populace žen. Candida albicans může růst jako hyfa, pseudohyfa, nebo rašící kvasinka. Dosažitelnost této různorodosti - vnitřní proměnlivosti morfologie je velkým přínosem pro patogenní život tohoto organismu. Změna morfologické formy z kvasinkové (blastospóry) na pseudomyceliární nebo myceliární (hyfovou) charakterizuje přechod z koloniálního statutu na invazivní. Vedle fyzikálně-chemických faktorů, zasahují do těchto transformačních dějů i quorum sensing látky - farnesol, který pokud je akumulován nad určitou mez, zabraňuje přeměnu z kvasinky na mycelium a tyrosol, který urychluje přeměnu v zárodečnou formu (germ tubes), tedy z kvasinky na vláknitou formu. Tato diplomová práce se zabývá vypracováním...
|
|
|
Porovnání možností UV a CAD detekce u vybraných skupin látek
Vrkočová, Kateřina ; Šatínský, Dalibor (oponent) ; Nováková, Lucie (vedoucí práce)
Tato diplomová práce byla zaměřena na porovnání možností UV a CAD detekce u vysoko účinné kapalinové chromatografie. Separace estrogenních steroidů a fenolických kyselin byla provedena na koloně Zorbax SB C18 (50x 4,6 mm; 1,8 µm). Stanovení probíhalo za současného použití dvou typů detekce: ultrafialová detekce (UV) a detekce nabitého aerosolu (Charged aerosol detection; CAD). V rámci optimalizace metody byly zjišťovány vhodné podmínky pro stanovení estrogenních steroidů a fenolických kyselin, zejména se zaměřením na dobrou citlivost CAD detektoru. Byl sledován vliv složení a koncentrace vodné složky mobilní fáze, rychlosti průtoku mobilní fáze a nastavení rozsahu CAD na jeho odezvu. Ke stanovení estrogenních steroidů byla použita gradientová eluce. Mobilní fáze se skládala z 0,1% kyseliny octové a acetonitrilu. Ke stanovení fenolických kyselin byla použita gradientová eluce. Mobilní fáze se skládala z 0,5% kyseliny mravenčí a metanolu. Součástí této diplomové práce bylo ověření vhodnosti použití detektoru Corona CAD. Za optimalizovaných podmínek umožňuje CAD současnou detekci β - estradiolu a jeho pěti možných nečistot. Při současném stanovení deseti fenolických kyselin CAD detekce neposkytla relevantní výsledky pro nejdéle eluovanou kyselinu skořicovou. Metoda pro estrogenní steroidy byla...
|
|
| |
|
|
Stanovení dusičnanů a dusitanů metodou SIA
Kymlová, Helena ; Sklenářová, Hana (oponent) ; Šatínský, Dalibor (vedoucí práce)
Byla vyvinuta nová metoda SIA pro současné stanovení dusitanů a dusičnanů. Dusitany byly analyzovány použitím Griessovy reakce. Dusičnany byly stanoveny po jejich redukci na dusitany v kadmiové koloně. Absorbance byla měřena při absorpčním maximu při 540 nm. Optimální podmínky pro analýzu: rychlost peristaltické pumpy pro stanovení dusitanů i dusičnanů 40 % maximální rychlosti pumpy; rychlost pístové pumpy pro dusitany i dusičnany 50 µl.s-1 ; dávkovaný objem dusitanů i dusičnanů 150 µl. Optimální čas redukce dusičnanů je při 0 s, tedy prostém průtoku dusičnanů redukční kolonou. Metoda byla použita pro analýzu dusitanů a dusičnanů ve vzorcích vod Fromin, Bonaqua, Rajec, Mattoni, hradecká voda. Hodnoty byly porovnány s hodnotami deklarovanými výrobci. Vyvinutá metoda SIA pro současné stanovení dusitanů a dusičnanů je používána jako nová praktická úloha v předmětu Speciální metody instrumentální analýzy.
|
|
|
Stanovení obsahových látek v lubrikačním gelu metodou plynové chromatografie
Ryšavá, Pavlína ; Matysová, Ludmila (vedoucí práce) ; Šatínský, Dalibor (oponent)
Souhrn Tato práce zpracovává téma Stanovení obsahových látek v lubrikačním gelu metodou plynové chromatografie a konkrétně se zabývá lubrikačním gelem Tea Tree Fantasy, který obsahuje přírodní substanci tea tree oil. TTO má silné antiseptické, antimykotické a protiplísňové účinky, a jeho důležitou germicidní aktivní složkou je terpinen-4-ol. Práce je rozdělena do osmi kapitol, hlavní část tvoří kapitoly 3 - 6. Třetí kapitola je věnována teoretické části, ve které je podrobně popsána plynová chromatografie, jako metoda vhodná pro stanovení terpinen-4-olu v lubrikačním gelu. Tato kapitola se také zabývá validací analytické metody a jednotlivými validačními parametry. Dále tato kapitola obsahuje charakteristiku lubrikačního gelu, tea tree oilu a terpinen-4-olu. Ve čtvrté kapitole je vypracována rešerše metod již použitých při stanovení látky terpinen-4-olu. Pátá kapitola se věnuje experimentální části a jsou v ní uvedeny všechny chemikálie, přístroje a podmínky separace. Šestá kapitola popisuje výsledky a diskuze nejprve při vývoji analytické metody, a následně při testu vhodnosti chromatografického systému a validaci metody. Smyslem této práce je tedy validace metody plynové chromatografie při stanovení terpinen-4-olu v lubrikačním gelu.
|
|
|
SIA stanovení dusitanů, dusičnanů a chloridů podle platných ISO norem
Dundová, Aneta ; Sklenářová, Hana (vedoucí práce) ; Šatínský, Dalibor (oponent)
Tato diplomová práce se zabývá tématem stanovení dusitanů, dusičnanů a chloridů metodou SIA upravenou podle platných ISO norem. Česká technická norma ČSN EN ISO 11 732 udává metodu vhodnou ke stanovení amoniakálního dusíku metodou FIA a CFA ve vodách různých druhů. Podstata zkoušky spočívá v aspiraci vzorku obsahující amoniakální dusík do kontinuálního proudícího nosného roztoku, kde se mísí s tokem alkalického roztoku. Amoniak se oddělí v difúzním segmentoru přes polopropustnou membránu a přechází do proudícího toku roztoku, ve kterém je indikátor pH. V důsledku změny hodnoty pH se mění zbarvení indikátoru, které je zaznamenáváno průtokovým spektrofotometrem. Bylo provedeno převedení uvedeného FIA stanovení daných iontů do SIA systému při dodržení kalibračních rozsahů z uvedené normy. Princip stanovení dusitanů je odlišný, byla použita Griess diazo-kopulační reakce za vzniku azobarviva měřitelného při 540 nm v průtokové cele spektrofotometru. Kalibrační křivka dusitanů vykazovala linearitu v rozmezí c = 0,01 - 0,1 mg/l a c = 0,1 - 1,0 mg/l s korelačními koeficienty R2 = 0,9979 a R2 = 0,9962. Roztok dusičnanů byl aspirován do redukční kolony zhotovené z kadmia a mědi. Po redukci NO3 - na NO2 - byl vzorek aspirován do systému, kde se mísil s činidlem a nakonec procházel průtokovou celou detektoru....
|
host ::
RSS.