|
|
Functional analysis of syntaxin 16 phosphorylation using yeast as a model
Volfová, Barbora ; Entlicher, Gustav (vedoucí práce) ; Dráber, Petr (oponent)
3 Abstrakt Mechanismus fúze intracelulárních membrán v eukaryotických buňkách zahrnuje několik skupin proteinů, včetně rodiny receptorů pro záchytný protein rozpusného N-ethylmaleinimid-senzitivního-faktoru (SNARE) a Sec1/Munc-18 příbuzných proteinů (SM proteinů). Je známo, že transport v buňkách je evolučně konzervovaný od kvasinek po člověka. Proto pro usnadnění výzkumu, můžeme použít jednoduché eukaryotní buňky Saccharomyces cerevisiae. Savčí SNARE protein syntaxin 16 má známý funkční kvasinkový homolog, protein Tlg2p, který byl použit v této studii jako model pro studium vlivu fosforylace na funkci syntaxinu 16. Také jejich vazebné partnery, SM proteiny mVps45p (savčí) a kvasinkový Vps45p, jsou homologní. Fosforylace SNARE proteinů je známá jako možný způsob regulace fúze membrán. Odstranění jednoho z možných fosforylačních míst na Tlg2p - serinu 90 významně ovlivňuje exocytické a endocytické pochody. Práce prezentovaná v této studii ukazuje některé fenotypy mutant založených na tomto fosforylačním místě proteinu Tlg2p. Těmi mutantami jsou S90A (nefosforylovatelná - mutace serinu na alanin) a S90D (fosfomimetická - mutace serinu na asparagovou kyselinu - kyselá karboxylová skupina napodobuje fosfátovou skupinu). Bylo zjištěno, že fosforylace proteinu Tlg2p na serinu 90 neboli mutace Tlg2p- S90D může...
|
|
|
Topografie signalizačních molekul na plazmatické membráně při aktivaci žírných buněk
Lebduška, Pavel ; Dráber, Petr (vedoucí práce) ; Šebo, Peter (oponent) ; Benada, Oldřich (oponent) ; Tučková, Ludmila (oponent)
|išitmezirůznýmimodeloými zástupcidanéhobuněčnéhotypu.Prezentovaná metodaizolacemembriínoýchlistuz neadherentníchbuněkby mohlavýzkum v tomtooboruusnadnit.Je všaktřebapřipomenout,Žeplastickéhoobrazuo přenosu signálupřesp|azmatickoumembrá'nujemožnodosáhnoutjensouhrouřady rozdilnýchavzájemněse doplňujícíchpřístupů. Závérv By|y vytvořeny tři způsobyizolacemembránových|istůz neadherentních žírnýchbuněk BMMC. Jedenz nich,založenýna adsorpci leukocytů ke sk|eněnémupovrchu,seukázal být zvláštěslibný a poskyt|řadu vědeckých dzt (čIánekE"). Aktivace žírnýchbuněk RBL dimerizacíreceptoruFceRI vedla k obohacení plazmatickémembrány o adaptoroý protein Grb2, který však'na rozdí| od případumultimerizacer€ceptoru' s FcaRI signiíikantněneko|oka|izoval a distribuceFceRI neby|ametodouimunoznačenímembránových|istů odlišitelnáod distribuce na neaktivovanýchbuňkách (čtánekA).Žírnébuňky BMMC' na rozdí|od buněk RBL' netvořily po mu|timerizacireceptoruvětší agregátyFceRI, nežbuňky neaktivované.Mu|timerizace receptoruFcaRI vedla u buněk BMMC a RBL k jeho internalizaci o srovnate|néintenzitěi celkové dynamice,ale lolcilní redistribuceFceRI se u nich zásadně|iši|a(článekE). Vžifýmode|rozsáhlých (přib|ižně200nm) signalizačníchdoméntohoto receptorubyl zpochybněn. Adaptorový protein NTAL by| v p|azmatickémembráně distribuován v...
|
|
| |
|
|
New aspects of the cell submembrane signaling
Heneberg, Petr ; Dráber, Petr (vedoucí práce) ; Bilej, Martin (oponent) ; Folk, Petr (oponent)
2 ABSTRAKT Tato disertace je příspěvkem k objasnění některých mechanismů submembránové signalizace savčích buněk. Hlavní část výzkumů byla provedena na žírných buňkách a bazofilech aktivovaných prostřednictvím vysokoafinitního receptoru pro IgE typu I, FcεRI, anebo membránovým glykoproteinem Thy-1. Jsou popsány nové role aktinového cytoskeletu v signalizaci žírných buněk přes FcεRI a Thy-1. Objev nového transmembránového adaptorového proteinu NTAL - z anglického "non-T cell activation linker" - krátce před započetím zpracovávání teze vedl ke zvýšené pozornosti věnované tomuto proteinu. Byly zjištěny a popsány významné změny v signalizaci žírných buněk s deficiencí v genu kódujícím protein NTAL, podobně též docházelo k výrazným změnám i v žírných buňkách, u kterých byla exprese proteinu NTAL jen snížena či zvýšena. Bylo dokumentováno, že NTAL je rovněž jedním z proteinů fosforylovaným po agregaci glykoproteinu Thy-1 na povrchu žírných buněk. Velká pozornost byla věnována časoprostorové distribuci glykoproteinu Thy-1 na různých úrovních rozlišení, přičemž byly zkoumány i některé biochemické charakteristiky buněk aktivovaných právě přes Thy-1 glykoprotein. V žírných buňkách a bazofilech byla zjišťována přítomnost dosud neznámých nereceptorových proteinových tyrosinových fosfatáz a následně byla provedena...
|
|
|
FcεRI and Kit signal to actin cytoskeleton via different pathways
Šimíček, Michal ; Drbal, Karel (oponent) ; Dráber, Petr (vedoucí práce)
Žírné buňky jsou klíčovými hráči na poli vrozené imunity. V minulosti byly tyto buňky zmiňovány zejména jako iniciátory alergických a zánětlivých reakcí. Současné poznatky ovšem naznačují jejich významnou roli též v boji proti bakteriím a virům. Nyní se navíc ukazuje unikátní postavení žírných buněk v regulaci adaptivní složky imunity. Z těchto důvodů je velmi důležité důkladné pochopení signálních dějů vedoucích k diferenciaci, lokalizaci a aktivaci žírných buněk. Poznání může ve výsledku vést k vývoji nových terapeutických přístupů. Stimulace povrchových receptorů žírných buněk, FcεRI a Kit, vede k fosforylaci transmembránového adaptorového proteinu NTAL a mimo jiné k rozprostírání žírných buněk na extracelulární matrix. Morfologické studie žírných buněk postrádajících protein NTAL odhalily výrazně snížené rozprostírání těchto buněk na fibronektinu po stimulaci Ag a kombinací Ag a SCF. Následná kvantifikace plochy pokryté buňkou a dalších morfologických parametrů potvrdila předchozí pozorování. Tento fenomén byl doprovázen poruchami v polymeraci actinu. Po blokaci integrínů specifickými protilátkami nebyly pozorovány poruchy v adhezi buněk bez exprese proteinu NTAL po aktivaci Ag nebo SCF. Pozorované defekty v buněčném rozprostírání tak byly pravděpodobně z důvodu pozměněné signalizace k...
|
|
| |
|
|
Dual role of CD9 protein in mast cell activation
Machyna, Martin ; Dráber, Petr (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent)
Žírne bunky sú známe efektorové bunky imunitného systemu. Ich účasť bola preukázaná v takých dôležitých procesoch ako sú obrana hostiteľa pred baktériami, toxínmi alebo parazitmi. Niekedy však môžu vytvárať neprimeranú reakciu proti neškodným antigénom v našom prostredí a spôsobovať tak alergie. Je práve preto vrcholne dôležité pochopiť signálne deje, ktoré vedú k aktivácii týchto buniek, za účelom vyvýjania nových stratégii liečby. Novovytvorená potkania monoklonálna protilátka izotypu IgG1, špecifická proti myším žírnym bunkám, bola charakterizovaná ako vhodná pre použitie v prietokovej cytometrii, imunoznačení a imunoprecipitácii. Použitie optimalizovaného postupu imunoizolácie v spojení s hmotnostnou spektrometriou umožnilo identifikovať CD9 ako jej cieľový proteín. CD9 je členom rozsiahlej rodiny nazývanej "tetraspanins". Funkčné štúdie ukázali, že väzba tejto protilátky na žírne bunky spôsobila degranuláciu a aktiváciu včasných dejov ako sú zvýšená tyrozínová fosforylácia a zvýšená hladina voľného cytoplazmatického vápnika. Prekvapivé bolo zistenie že, následná aktivácia týchto buniek cez agregáciu FcεRI receptoru pomocou antigénu viedla naopak ku zníženej degranulácii, vápnikovej odpovedi a tyrozínovej fosforylácii niekoľkých substrátov. Anti-CD9 protilátka však neinhibovala tieto bunkové odpovede,...
|
|
| |
|
|
New signaling pathways involved in mast cell activation and cell membrane repair
Shaik, Gouse Mohiddin ; Dráber, Petr (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent) ; Hašek, Jiří (oponent)
RESULTS 54 RESULTS AND DISCUSSION Vacuolin-1-induced changes in mast cells morphology In pilot experiments we determined the effect of vacuolin-1 on mast cell morphology. Incubation of RBL-2H3 cells or BMMCs with 10 μM vacuolin-1 in complete culture media for 3 h resulted in appearance of numerous vacuoles in cytosolic compartment of the cells (Fig 1A-D). Size of the vacuolin-1-treated cells rose (Fig 1E and F) as reflected by mean increase in diameter of RBL-2H3 cells from 14.8 ± 0.2 μm (mean ± S.D., n = 3) to 18.8 ± 0.3 μm, and BMMCs from 14.6 ± 0.2 μm to 17.3 ± 0.2 μm. To decide whether formation of vacuoles depends on specific metabolic pathways we examined cells exposed to various concentrations of pharmacological inhibitors and 10 μM vacuolin-1. Data presented in Table 1 show that most of the drugs tested, including Cl- and/or K+ channel blockers [indanyloxyacetic acid 94 (IAA-94), (dihydroindenyl)oxy/alkanoic acid (DIOA), 5- Nitro-2-(3-phenylpropylamino)-benzoic acid (NPPB), 4,4'-diisothiocyanatostilbene-2,2'- disulphonate (DIDS) and glybenclamide], protein kinase C (PKC) inhibitor (tamoxifen), phosphoinositid-3 kinase (PI3K) inhibitor (wortmannin), Src and Syk family kinase inhibitors (PP2 and piceatannol) and non-muscle myosin (NMM) II ATPase activity inhibitor (blebbistatin)...
|
|
| |
host ::
RSS.