|
|
Detekce histidinem a FLAG peptidem značených rekombinantních proteinů
Javorská, Lenka ; Zemanová, Lucie (vedoucí práce) ; Novotná, Eva (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Bc. Lenka Javorská Školitel: RNDr. Lucie Škarydová, Ph.D. Název diplomové práce: Detekce histidinem a FLAG peptidem značených rekombinantních proteinů Rekombinantní proteiny jsou proteiny produkované geneticky modifikovanými organismy, prostřednictvím rekombinantní DNA technologie, jejímž principem je vložení DNA sekvence kódující cílový protein do buněk expresního systému, který zajistí jeho produkci. Tato technologie umožňuje připravit v podstatě libovolný protein v jakémkoliv požadovaném množství. Rekombinantní proteiny jsou produkovány často ve formě fúzního proteinu s vhodnou afinitní značkou (např. histidinová nebo FLAG peptidová značka), která usnadní jejich purifikaci a detekci. Cílem této diplomové práce bylo zavést a optimalizovat univerzální metodu pro detekci rekombinantních proteinů značených histidinovou (6x histidin) a FLAG peptidovou značkou. Modelovým rekombinantním proteinem s histidinovou značkou byl enzym karbonylreduktasa 1 (CBR1) produkovaný expresním systémem bakterie Escherichia coli a pro rekombinantní proteiny značené FLAG peptidem enzymy DHRS12, HSD11β1, RODH4, DHRS3, DHRS7, DHRS8 (expresní systém - hmyzí buňky Sf9). Pro separaci proteinů byla zvolena SDS polyakrylamidová...
|
|
|
Optimalizace postupu izolace fosforylovaných peptidů ze směsi metodou afinitní chromatografie na oxidech kovů pro analýzu hmotnostní spektrometrií
Popovská, Lenka ; Solich, Petr (vedoucí práce) ; Zemanová, Lucie (oponent)
Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra analytické chemie Kandidát: Mgr. Lenka Popovská Školitel: Prof. RNDr. Petr Solich, CSc. Školitel specialista: Mgr. Barbora Šalovská, Ph.D. Název rigorózní práce: Optimalizace postupu izolace fosforylovaných peptidů ze směsi metodou afinitní chromatografie na oxidech kovů pro analýzu hmotnostní spektrometrií. Fosforylace proteinů je klíčovým regulačním mechanismem buněčné signalizace. Je součástí většiny buněčných dějů, jež se odehrávají za komplexní souhry proteinkináz a proteinfosfatáz, a mezi které řadíme především proliferaci, diferenciaci a apoptózu. Defektní či pozměněné signální dráhy mohou vést ke vzniku různých chorob, a proto je velmi důležité proteinovou fosforylaci podrobně studovat a snažit se jí co nejvíce porozumět. Technologický vývoj hmotnostní spektrometrie (MS) posledních let umožnil výrazné zvýšení počtu fosforylačních míst, které mohou být ve vzorku identifikovány. Zvyšující se skenovací rychlost společně s komerční dostupností MS s vysokým rozlišením zvýšily množství a kvalitu dat, které mohou být získány v relativně krátkém čase. Avšak ani špičkové přístroje by neumožnily komplexní identifikaci fosforylačních míst v enzymatických lyzátech (digestech) vzorků, pokud by samotné analýze nepředcházela některá z...
|
|
|
Optimalizace exprese vybrané lidské karbonylreduktasy v Escherichia coli
Ježková, Veronika ; Novotná, Eva (vedoucí práce) ; Zemanová, Lucie (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Řešitel: Bc. Veronika Ježková Vedoucí práce: RNDr. Eva Novotná, PhD. Název práce: Optimalizace exprese vybrané lidské karbonylreduktasy v Escherichia coli Diplomová práce s názvem Optimalizace exprese vybrané lidské karbonylreduktasy v Escherichia coli je členěna na dvě části, teoretickou a experimentální. Teoretická část představuje stručný souhrn informací o vybraných enzymech karbonylreduktase 1 (CBR1), chinon-oxidoreduktase (NQO1) a enzymu DHRS2 (Hep27). Její součástí je i teoretický souhrn laboratorních metod, které byly použity v experimentální části. Experimentální část si klade za cíl optimalizaci expresních podmínek těchto vybraných enzymů v bakteriálním expresním systému Lemo21(DE3). Plasmid pET-28b(+), který kóduje naše vybrané enzymy, jsme teplotním šokem transformovali do kompetentních bakteriálních buněk Lemo21(DE3), v nichž probíhala proteinová exprese za různých koncentrací L-rhamnosy. Exprimovaný rekombinantní protein NQO1 jsme poté purifikovali metodou afinitní chromatografie. Úspěšnost exprese proteinů jsme ověřovali SDS-PAGE, popřípadě pomocí Western Blotu. Z výsledků získaných elektroforézou je patrné, že se podařilo úspěšně exprimovat enzym karbonylreduktasu 1 za různých koncentrací...
|
|
|
Vyhledání referenčních genů pro relativní kvantifikaci mRNA z Haemonchus contortus
Růžičková, Michaela ; Matoušková, Petra (vedoucí práce) ; Zemanová, Lucie (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Michaela Růžičková Školitel: Ing. Petra Matoušková, Ph.D. Název diplomové práce: Vyhledání referenčních genů pro relativní kvantifikaci mRNA z Haemonchus contortus Haemonchus contortus je parazitická hlístice, jejíž multirezistence k anthelminti- kům je celosvětovým problémem ohrožujícím hlavně chovy malých přežvý- kavců. V roce 2013 byl publikován její genom a transkriptom, což umožnilo rozsáhlý výzkum genové exprese. Referenční geny pro tyto studie prozatím ne- byly stanoveny. Použití vhodných referenčních genů je nezbytné pro správnou normalizaci hladin exprese genů. Cílem této práce bylo navrhnout a zhodnotit potenciální referenční geny pro studie genové exprese u dospělců H. contortus. Navrženo bylo 11 genů, stabilita jejich exprese byla hodnocena na samcích a sa- micích dvou kmenů H. contortus, jednoho na anthelmintika vnímavého (ISE) a druhého multirezistentního (WR). Z jedinců byla extrahována RNA, přepsána reverzní transkripcí do cDNA. Tato byla zředěna a analyzována kvantitativní real-time PCR s detekcí pomocí SYBR Green I. Stabilita exprese byla hodnocena počítačovými programy BestKeeper, geNorm, NormFinder a komparativní CT metodou. Nejstabilnějšími geny se jeví ncbp, ama, sodc, gapdh a...
|
|
|
Apoptóza a její role u vybraných chorob
Černá, Hana ; Kvasničková, Eva (vedoucí práce) ; Zemanová, Lucie (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemickčh vûd Kandidát: Hana âerná ·kolitel: Prof. RNDr. Eva Kvasniãková, CSc. Název diplomové práce: Apoptóza a její role u vybrančh chorob Apoptóza, jeÏ pfiedstavuje specifickou formu programové bunûãné smrti, patfií k základním fyziologick˘m procesÛm. Je velmi dÛleÏitá pro v˘voj organismu i pro udrÏení tkáÀové homeostasy. Jedná se o vysoce regulovan˘ proces, k jehoÏ spu‰tûní dochází vÏdy na základû urãitého signálu. Ten aktivuje specifické apoptické dráhy, sled mechanismÛ, které postupnû vedou k bunûãnému zániku. Dysregulace apoptózy je spojena s fiadou patologickčh stavÛ jako jsou nádorová onemocnûní, nûkteré poruchy imunitního systému, kardiovaskulárního systému ãi neurologická onemocnûní. Mezi poslední jmenované patfií neurodegenerativní choroby charakteristické zánikem selektivních neuronálních populací. Konkrétním pfiíkladem jsou Alzheimerova a Parkinsonova choroba. PfiestoÏe patogeneze tûchto onemocnûní není doposud plnû objasnûna, fiada studií naznaãuje, Ïe by ztráta neuronÛ mohla úzce souviset s nadmûrnou apoptickou aktivitou. I pfies urãité nesrovnalosti se proto pfiedpo- kládá, Ïe by apoptóza mohla bť vžnamnou souãástí patogeneze tûchto onemocnûní. Alzheimerova a Parkinsonova choroba patfií k nejzávaÏnûj‰ím...
|
|
|
Vyhledání referenčních genů pro relativní kvantifikaci mRNA z Haemonchus contortus
Růžičková, Michaela ; Matoušková, Petra (vedoucí práce) ; Zemanová, Lucie (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Michaela Růžičková Školitel: Ing. Petra Matoušková, Ph.D. Název diplomové práce: Vyhledání referenčních genů pro relativní kvantifikaci mRNA z Haemonchus contortus Haemonchus contortus je parazitická hlístice, jejíž multirezistence k anthelminti- kům je celosvětovým problémem ohrožujícím hlavně chovy malých přežvý- kavců. V roce 2013 byl publikován její genom a transkriptom, což umožnilo rozsáhlý výzkum genové exprese. Referenční geny pro tyto studie prozatím ne- byly stanoveny. Použití vhodných referenčních genů je nezbytné pro správnou normalizaci hladin exprese genů. Cílem této práce bylo navrhnout a zhodnotit potenciální referenční geny pro studie genové exprese u dospělců H. contortus. Navrženo bylo 11 genů, stabilita jejich exprese byla hodnocena na samcích a sa- micích dvou kmenů H. contortus, jednoho na anthelmintika vnímavého (ISE) a druhého multirezistentního (WR). Z jedinců byla extrahována RNA, přepsána reverzní transkripcí do cDNA. Tato byla zředěna a analyzována kvantitativní real-time PCR s detekcí pomocí SYBR Green I. Stabilita exprese byla hodnocena počítačovými programy BestKeeper, geNorm, NormFinder a komparativní CT metodou. Nejstabilnějšími geny se jeví ncbp, ama, sodc, gapdh a...
|
|
|
Zavedení afinitní separace do purifikačního protokolu lidských membránově vázaných enzymů redukujícících karbonylové sloučeniny
Štýbnarová, Radka ; Zemanová, Lucie (vedoucí práce) ; Skarka, Adam (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Radka Štýbnarová Školitel: RNDr. Lucie Zemanová, Ph.D. Název diplomové práce: Zavedení afinitní separace do purifikačního protokolu lidských membránově vázaných enzymů redukujících karbonylové sloučeniny Karbonyl-redukující enzymy hrají důležitou roli v metabolismu mnohých eobiotik (steroidů, prostaglandinů) i xenobiotik (doxorubicinu, daunorubicinu, oracinu, NNK, haloperidolu). Vzhledem k jejich substrátové specifitě hrají také důležitou roli ve vývoji některých onemocnění, jako je rakovina závislá na hormonech nebo metabolický syndrom. Zatímco cytosolické karbonyl-redukující enzymy jsou dobře charakterizovány, informací o membránově vázaných je vzhledem k jejich náročnému studování podstatně méně. V současnosti jsou popsány pouze tři mikrosomální karbonyl-redukující enzymy účastnící se metabolismu xenobiotik (11β-HSD1, DHRS7 and DHRS3), z nichž pouze 11β-HSD1 je dobře charakterizována. Nicméně, na základě výzkumu protinádorového léčiva oracinu a jeho stereospecifity redukce se předpokládá existence dalších mikrosomálních karbonyl-redukujících enzymů, účastnících se jeho metabolismu a inaktivace. Abychom mohli izolovat tyto "neznámé" enzymy, byl vyvinut afinitní nosič s imobilizovaným ligandem...
|
|
|
Koimunoprecipitace jako nástroj pro studium interakcí DHRS7 enzymu s proteiny
Fassmannová, Dominika ; Zemanová, Lucie (vedoucí práce) ; Matoušková, Petra (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Dominika Fassmannová Školitel: RNDr. Lucie Zemanová, Ph.D. Název diplomové práce: Koimunoprecipitace jako nástroj pro studium interakcí enzymu DHRS7 s proteiny DHRS7 enzym je člen nadrodiny enzymů dehydrogenáz/reduktáz s krátkým řetězcem. Enzym se in vitro chová jako NADPH-dependentní reduktáza s katalytickou aktivitu pro některé endogenní sloučeniny obsahující karbonylovou skupinu, zahrnující androstendion nebo trans-retinal. Vykazuje také úzkou homologii s enzymem 11β-hydroxysteroiddehydrogenáza 1. Fyziologická funkce DHRS7 je zatím neznámá a úroveň poznání enzymu velmi nízká. V poslední době se objevují informace o roli DHRS7 v některých onemocnění, např. v rakovině prostaty nebo v inzulínové rezistenci. Role málo charakterizovaného enzymu DHRS7 může být poodhalena na základě znalosti jeho interakčních partnerů, protože proteiny v buňce obvykle nepracují samy, ale jsou součástí obrovského proteinového komplexu, označeného jako "interactome". Poznání takových interakcí nám pomáhá porozumět funkci a regulaci proteinů uvnitř buněk nebo organismu. Cílem této studie je výzkum proteinů interagujících s DHRS7 pomocí metody koimunoprecipice. Imunoprecipitace byla zavedena s využitím dostupné protilátky...
|
|
|
Klonování, exprese a purifikace disulfid oxidoreduktázy Francisella tularensis
Kohlová, Michaela ; Šimůnek, Tomáš (vedoucí práce) ; Zemanová, Lucie (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Bc. Michaela Kohlová Školitel: doc. PharmDr. Tomáš Šimůnek Školitel-konzultant: Mgr. Monika Schmidt Název diplomové práce: Konstrukce, exprese a purifikace disulfid oxidoreduktázy Francisella tularensis Konzervovaný hypotetický lipoprotein s označením FTT1103 (pro Francisella tularensis subsp. tularensis) je jedním z faktorů virulence u gramnegativní intracelulární bakterie Francisella tularensis. Protein FTT1103 je homologem k periplazmatickému proteinu DsbA E. coli, patří do rodiny disulfid oxidoreduktáz a je zodpovědný za tvorbu disulfidických vazeb u nově vzniklých proteinů. Tyto vazby jsou v proteinech nezbytné pro udržení správné konformace a aktivity. Bioinformatická analýza proteinu FTT1103 ukázala, že tento protein obsahuje N-koncovou FKBP doménu, u které se předpokládá dimerizační funkce a/nebo funkce chaperonová. Tyto funkce domény však nebyly dosud zcela potvrzeny. Cílem této diplomové práce bylo ověření, zda je N-koncová FKBP doména skutečně zodpovědná za správnou funkci a aktivitu proteinu DsbA. Pomocí molekulárně biologických metod jsme připravili mutantní gen dsbA s deletovanou FKBP_N doménou (dsbAΔFKBP_N). Tento gen jsme pomocí klonování vložili do plazmidu pET28b a tento...
|
|
|
Vliv monepantelu na expresi biotransformačních enzymů ovce
Štolcová, Tereza ; Skálová, Lenka (vedoucí práce) ; Zemanová, Lucie (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Tereza Štolcová Školitel: prof. RNDr. Lenka Skálová Ph.D. Název práce: Vliv monepantelu na expresi biotransformačních enzymů ovce Monepantel (MOP) představuje nové anthelmintikum ze skupiny amino-acetonitrilových derivátů, s odlišným mechanismem účinku oproti klasickým širokospektrým anthelmintikům. Používá se na léčbu a kontrolu gastrointestinálních nematodóz u ovcí a skotu. Tato práce se zaměřuje na vliv MOP na expresi vybraných cytochromů P450 (CYP) u ovcí in vivo a in vitro. K in vivo experimentům byla použita játra ovcí, kterým byl podán MOP v doporučené terapeutické dávce. Kontrolní skupině zvířat nebylo léčivo podáno. Při in vitro pokusech byly pozorovány změny v expresi mRNA vybraných CYP po 24 hodinové inkubaci primárních kultur ovčích hepatocytů s 10 μM MOP. Ke stanovení transkripčních hladin mRNA byla využita metoda qPCR (kvantitativní PCR v reálném čase). Výsledky in vivo i in vitro experimentů svědčí o výrazném nárůstu v expresi isoformy CYP3A24. Indukční efekt monepantelu byl dokonce vyšší, než indukční efekt známého CYP3A induktoru rifampicinu. Indukce enzymů CYP3A může mít vážné farmakologické anebo toxikologické důsledky. Při současném (případně následném) podání jiných léčiv s MOP...
|
host ::
RSS.