|
|
Signaling effects of adenylate cyclase toxin action on phagocytes
Černý, Ondřej ; Šebo, Peter (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent) ; Dráber, Petr (oponent)
Adenylát-cyklázový toxin (CyaA) je klíčovým faktorem virulence bakterie Bordetella pertussis. CyaA se váže na fagocyty produkující komplementový receptor 3 (CR3) a následně katalyzuje přeměnu vnitrobuněčného ATP na významného "druhého posla" cAMP. Tímto paralyzuje schopnost neutrofilů a makrofágů zabíjet bakterie pomocí oxidativního vzplanutí a mechanismů závislých na fagocytóze. V této práci analyzujeme mechanismus, kterým CyaA blokuje produkci baktericidních reaktivních kyslíkových a dusíkových radikálů neutrofily a makrofágy. CyaA potlačuje produkci reaktivních kyslíkových radikálů (ROS, z angl. "reactive oxygen species") jednak prostřednictvím inhibice PLC přes PKA a dále nejspíše ovlivněním skládání komplexu NADPH oxidázy prostřednictvím aktivace proteinu Epac. Selektivní aktivace PKA nebo Epac blokovala produkci ROS indukovanou fMLP. Inhibice PKA pomocí specifických inhibitorů navíc vedla jen k částečnému obnovení produkce ROS u neutrofilů vystavených CyaA. Signalizace CyaA/cAMP následně omezila tvorbu DAG, zatímco tvorba PIP3 zůstala neovlivněna. Tyto výsledky naznačují, že působení CyaA může ovlivnit lipidické složení membrány fagocytů. Dále jsme ukázali, že aktivace PKA pomocí cAMP vyvolává aktivaci tyrozínové fosfatázy SHP-1. To v makrofázích způsobí potlačení produkce reaktivních...
|
|
|
Multiple regulatory roles of the transmembrane adaptor protein NTAL in gene transcription and mast cell physiology
Polakovičová, Iva ; Dráber, Petr (vedoucí práce) ; Vyklický, Ladislav (oponent) ; Hašek, Jiří (oponent)
(CZ) Tato dizertační práce se zaměřuje především na pochopení regulačních úloh transmembránových adaptorových proteinů NTAL ("non-T cell activation linker") a PAG ("phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains") v aktivaci myších žírných buněk. V odborné literatuře existují protikladné studie o úloze proteinu NTAL v aktivační dráze vysoce afinního receptoru pro imunoglobulin E (IgE) (FcεRI). Studie prováděné na žírných buňkách připravených z myší s genovým knockoutem NTALu naznačují, že NTAL je negativní regulátor FcεRI signalizace, zatímco experimenty provedené na lidských žírných buňkách a buňkách bazofilní leukemie potkana s potlačenou expresí proteinu NTAL mu připisují pozitivní regulační roli. Abychom pochopili zapojení proteinu NTAL v FcεRI zprostředkované signalizaci v myších žírných buňkách a určili, zda různé metodiky delece NTALu mají různé fyziologické následky, použili jsme široké spektrum testů. Jako model jsme použili žírné buňky odvozené z kostní dřeně (BMMC) a připravili jsme BMMC z myší NTAL divokého typu ("wild type") a myší s genovým knockoutem NTALu. Pomocí lentivirových vektorů jsme transdukovali část buněk divokého typu vektorem nesoucím NTAL shRNA ("short hairpin RNA") pro generování buněk s potlačenou expresí NTALu ("knockdown") nebo prázdným...
|
|
|
Regulation of mast cell activation at the level of the high-affinity IgE receptor and STIM1
Bugajev, Viktor ; Dráber, Petr (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent) ; Hašek, Jiří (oponent)
(CZ) Tato disertační práce je zaměřena na dva důležité regulátory signalizace žírných buněk. Prvním z nich je komplex vysoce afinního receptoru pro imunoglobulin E (IgE) (FcεRI), který se podílí na získaných (adaptivních) imunitních odpovědí a druhý je stromální interakční molekula 1 (STIM1), která monitoruje hladiny vápníku v endoplasmickém retikulu (ER) a po uvolnění Ca2+ z ER se podílí na otevření vápníkovým uvolněním aktivovaných vápníkových (CRAC) kanálů. I když je struktura FcεRI známá již mnoho let a byla popsána řada molekul asociovaných s tímto receptorem, přesný molekulární mechanismus zahájení a ukončení FcεRI signalizace zůstává nejasný. V této studii jsme vyhodnotili dosavadní poznatky o molekulárních mechanismech iniciace fosforylace FcεRI s důrazem na nově popsaný model, podle kterého vzájemné interakce mezi protein tyrosin fosfatázami (PTPs) a protein tyrosin kinázami (PTKs) nastaví práh tyrosinové fosforylace FcεRI (PTK-PTP interakční model). Dále jsme rozšířili poznatky týkající se topografie fosfatáz citlivých k oxidaci po stimulaci FcεRI v rámci klastrů transmembrálních adaptorových proteinů: T buňky neaktivující "linker" (NTAL) a "linker" aktivovaných T lymfocytů (LAT). Žírné buňky původem z kostní dřeně (BMMC) jsme použili jako modelový systém pro získání nových poznatků o...
|
|
|
Regulatory functions of the transmembrane adaptor protein NTAL in activation of mast cells
Tůmová, Magda ; Dráber, Petr (vedoucí práce) ; Vyklický, Ladislav (oponent) ; Hašek, Jiří (oponent)
SOUHRN Žírné buňky pocházejí z kmenových buněk kostní dřeně. Tyto buňky necirkulují v krvi, ale nachází se v celé řadě tkání, kde jsou často umístěny v blízkosti cév. Žírné buňky jsou součástí přirozeného imunitního systému, ale zároveň ovlivňují i adaptivní imunitní systém a také se účastní alergických a zánětlivých reakcí. Žírné buňky mají na svém povrchu vysokoafinitní receptor pro IgE (FcεRI). Prokřížení tohoto receptoru spouští kaskádu reakcí, která vede k uvolnění předpřipravených a nově syntetizovaných efektorových molekul. Časné fáze aktivace těchto buněk zahrnují tyrosinovou fosforylaci četných substrátů a formování signálních komplexů (v angl. "signalosomes"). Důležité strukturní prvky těchto komplexů jsou transmembránové adaptorové proteiny. Jedním takovým proteinem je adaptorový protein NTAL (Non-T cell Activation Linker), který je velmi rychle fosforylován na tyrosinových zbytcích po prokřížení FcεRI a který slouží jako pozitivní, ale i negativní regulátor signálních drah FcεRI. Abychom byli schopni studovat podrobnou topografii proteinu NTAL a dalších molekul plazmatické membrány u žírných buněk odvozených z kostní dřeně (BMMC), nejprve jsme vyvinuli novou metodu izolace listů plazmatické membrány neadherentních buněk. Tato metoda je založena na adsorpci buněk k ultračistému mikroskopickému...
|
|
|
Úloha metabotropních glutamátových receptorů a proteinů, které s nimi interagují, ve fyziologické signalizaci a v patologii
Kumpošt, Jiří ; Blahoš, Jaroslav (vedoucí práce) ; Dráber, Petr (oponent) ; Viklický, Vladimír (oponent)
Glutamát, který je hlavním excitačním přenašečem v mozku savců, aktivuje jak ionotropní receptory tak metabotropní glutamátové receptory. Ionotropní receptory jsou zodpovědné za rychlý synaptický přenos vedoucí k depolarizaci postsynaptické membrány a vtoku Ca2+ do buňky. Metabotropní glutamátové receptory přes heterotrimerní G-proteiny modulují glutamátovou signalizaci pomocí modulace řady signálních drah. Postsynapticky lokalizované receptory z 1. skupiny mGlu receptorů (mGluR1,5) spolu s ionotropními NMDA a AMPA receptory sdílejí společný "signalosom", tedy soubor molekul, které ovlivňují, nebo se přímo účastní signalizace glutamátových receptorů. Napojení na signalosom se liší u sestřihových variant mGluR1 včetně napojení na "scaffold" proteiny, jako je PSD-95, organizující proteiny postsynaptické denzity. Heterodimerizace mGluR1 ve smyslu sestřihových variant je ústředním tématem této práce spolu se studiem role nedávno objeveného proteinu IL1RAPL1 (interleukin-1 receptor accessory protein-like 1) v organizaci postsynaptického signalosomu. mGluR1 má u člověka minimálně dvě sestřihové varianty - mGluR1a a mGluR1b. Pomocí biochemických, imunocytochemických a funkčních testů jsme ukázali, že v heterologním expresním systému jsou heterodimery mGluR1a/1b povrchově exprimované a že tyto receptory...
|
|
|
Functional analysis of syntaxin 16 phosphorylation using yeast as a model
Volfová, Barbora ; Entlicher, Gustav (vedoucí práce) ; Dráber, Petr (oponent)
3 Abstrakt Mechanismus fúze intracelulárních membrán v eukaryotických buňkách zahrnuje několik skupin proteinů, včetně rodiny receptorů pro záchytný protein rozpusného N-ethylmaleinimid-senzitivního-faktoru (SNARE) a Sec1/Munc-18 příbuzných proteinů (SM proteinů). Je známo, že transport v buňkách je evolučně konzervovaný od kvasinek po člověka. Proto pro usnadnění výzkumu, můžeme použít jednoduché eukaryotní buňky Saccharomyces cerevisiae. Savčí SNARE protein syntaxin 16 má známý funkční kvasinkový homolog, protein Tlg2p, který byl použit v této studii jako model pro studium vlivu fosforylace na funkci syntaxinu 16. Také jejich vazebné partnery, SM proteiny mVps45p (savčí) a kvasinkový Vps45p, jsou homologní. Fosforylace SNARE proteinů je známá jako možný způsob regulace fúze membrán. Odstranění jednoho z možných fosforylačních míst na Tlg2p - serinu 90 významně ovlivňuje exocytické a endocytické pochody. Práce prezentovaná v této studii ukazuje některé fenotypy mutant založených na tomto fosforylačním místě proteinu Tlg2p. Těmi mutantami jsou S90A (nefosforylovatelná - mutace serinu na alanin) a S90D (fosfomimetická - mutace serinu na asparagovou kyselinu - kyselá karboxylová skupina napodobuje fosfátovou skupinu). Bylo zjištěno, že fosforylace proteinu Tlg2p na serinu 90 neboli mutace Tlg2p- S90D může...
|
|
|
Topografie signalizačních molekul na plazmatické membráně při aktivaci žírných buněk
Lebduška, Pavel ; Dráber, Petr (vedoucí práce) ; Šebo, Peter (oponent) ; Benada, Oldřich (oponent) ; Tučková, Ludmila (oponent)
|išitmezirůznýmimodeloými zástupcidanéhobuněčnéhotypu.Prezentovaná metodaizolacemembriínoýchlistuz neadherentníchbuněkby mohlavýzkum v tomtooboruusnadnit.Je všaktřebapřipomenout,Žeplastickéhoobrazuo přenosu signálupřesp|azmatickoumembrá'nujemožnodosáhnoutjensouhrouřady rozdilnýchavzájemněse doplňujícíchpřístupů. Závérv By|y vytvořeny tři způsobyizolacemembránových|istůz neadherentních žírnýchbuněk BMMC. Jedenz nich,založenýna adsorpci leukocytů ke sk|eněnémupovrchu,seukázal být zvláštěslibný a poskyt|řadu vědeckých dzt (čIánekE"). Aktivace žírnýchbuněk RBL dimerizacíreceptoruFceRI vedla k obohacení plazmatickémembrány o adaptoroý protein Grb2, který však'na rozdí| od případumultimerizacer€ceptoru' s FcaRI signiíikantněneko|oka|izoval a distribuceFceRI neby|ametodouimunoznačenímembránových|istů odlišitelnáod distribuce na neaktivovanýchbuňkách (čtánekA).Žírnébuňky BMMC' na rozdí|od buněk RBL' netvořily po mu|timerizacireceptoruvětší agregátyFceRI, nežbuňky neaktivované.Mu|timerizace receptoruFcaRI vedla u buněk BMMC a RBL k jeho internalizaci o srovnate|néintenzitěi celkové dynamice,ale lolcilní redistribuceFceRI se u nich zásadně|iši|a(článekE). Vžifýmode|rozsáhlých (přib|ižně200nm) signalizačníchdoméntohoto receptorubyl zpochybněn. Adaptorový protein NTAL by| v p|azmatickémembráně distribuován v...
|
|
| |
|
|
New aspects of the cell submembrane signaling
Heneberg, Petr ; Dráber, Petr (vedoucí práce) ; Bilej, Martin (oponent) ; Folk, Petr (oponent)
2 ABSTRAKT Tato disertace je příspěvkem k objasnění některých mechanismů submembránové signalizace savčích buněk. Hlavní část výzkumů byla provedena na žírných buňkách a bazofilech aktivovaných prostřednictvím vysokoafinitního receptoru pro IgE typu I, FcεRI, anebo membránovým glykoproteinem Thy-1. Jsou popsány nové role aktinového cytoskeletu v signalizaci žírných buněk přes FcεRI a Thy-1. Objev nového transmembránového adaptorového proteinu NTAL - z anglického "non-T cell activation linker" - krátce před započetím zpracovávání teze vedl ke zvýšené pozornosti věnované tomuto proteinu. Byly zjištěny a popsány významné změny v signalizaci žírných buněk s deficiencí v genu kódujícím protein NTAL, podobně též docházelo k výrazným změnám i v žírných buňkách, u kterých byla exprese proteinu NTAL jen snížena či zvýšena. Bylo dokumentováno, že NTAL je rovněž jedním z proteinů fosforylovaným po agregaci glykoproteinu Thy-1 na povrchu žírných buněk. Velká pozornost byla věnována časoprostorové distribuci glykoproteinu Thy-1 na různých úrovních rozlišení, přičemž byly zkoumány i některé biochemické charakteristiky buněk aktivovaných právě přes Thy-1 glykoprotein. V žírných buňkách a bazofilech byla zjišťována přítomnost dosud neznámých nereceptorových proteinových tyrosinových fosfatáz a následně byla provedena...
|
|
|
FcεRI and Kit signal to actin cytoskeleton via different pathways
Šimíček, Michal ; Drbal, Karel (oponent) ; Dráber, Petr (vedoucí práce)
Žírné buňky jsou klíčovými hráči na poli vrozené imunity. V minulosti byly tyto buňky zmiňovány zejména jako iniciátory alergických a zánětlivých reakcí. Současné poznatky ovšem naznačují jejich významnou roli též v boji proti bakteriím a virům. Nyní se navíc ukazuje unikátní postavení žírných buněk v regulaci adaptivní složky imunity. Z těchto důvodů je velmi důležité důkladné pochopení signálních dějů vedoucích k diferenciaci, lokalizaci a aktivaci žírných buněk. Poznání může ve výsledku vést k vývoji nových terapeutických přístupů. Stimulace povrchových receptorů žírných buněk, FcεRI a Kit, vede k fosforylaci transmembránového adaptorového proteinu NTAL a mimo jiné k rozprostírání žírných buněk na extracelulární matrix. Morfologické studie žírných buněk postrádajících protein NTAL odhalily výrazně snížené rozprostírání těchto buněk na fibronektinu po stimulaci Ag a kombinací Ag a SCF. Následná kvantifikace plochy pokryté buňkou a dalších morfologických parametrů potvrdila předchozí pozorování. Tento fenomén byl doprovázen poruchami v polymeraci actinu. Po blokaci integrínů specifickými protilátkami nebyly pozorovány poruchy v adhezi buněk bez exprese proteinu NTAL po aktivaci Ag nebo SCF. Pozorované defekty v buněčném rozprostírání tak byly pravděpodobně z důvodu pozměněné signalizace k...
|
host ::
RSS.