|
|
Regulation of cell cycle and DNA damage response in mouse oocytes.
Mayer, Alexandra ; Šolc, Petr (vedoucí práce) ; Macůrek, Libor (oponent) ; Macek, Milan (oponent)
Buněčný cyklus savčích oocytů je dočasně zastaven v průběhu profáze I. meiotického dělení a v tomto stádiu mohou oocyty přetrvávat až několik desítek let. V oocytech proto musí fungovat účinné mechanismy, které je udržují v profázi I a umožňují znovuzahájení meiózy, když je potřeba. Následně, správná segregace chromozomů během maturace oocytů je podmínkou pro vývoj zdravých potomků. Naším cílem bylo zjistit nové role AURKA a PLK1 kináz v regulaci buněčného cyklu. Použili jsme transgenní myši, které nadprodukují wild type (WT-) nebo neaktivní (kinase- dead, KD-) AURKA pouze v oocytech, a ke studiu PLK1 kinázy jsme použili specifický inhibitor BI2536, jehož účinnost je ověřená v somatických buňkách. Naše data ukazují, že jak AURKA tak PLK1 nejsou nezbytné pro znovuzahájení meiózy, i když obě kinázy se tohoto procesu účastní. Aktivní AURKA reguluje proces multiplikace mikrotubuly organizujících center (MTOC) v profázi I, což je první viditelná známka znovuzahajení meiózy. Aktivace AURKA je bifázní, proto primární nárůst počtu MTOC je tranzientní. Plná aktivace AURKA, která je potřebná pro stabilitu MTOC, vyžaduje aktivitu Cyklin-dependentní kinázy 1 (CDK1). Ukázali jsme, že PLK1 se účastní rozpadu jaderné membrány během znovuzahájení meiózy. Jak AURKA tak PLK1 se podílí na akumulaci centrozomálních...
|
|
|
Molekulární mechanismy regulace G2/M kontrolního bodu
Kořínková, Klára ; Macůrek, Libor (vedoucí práce) ; Forman, Martin (oponent)
Buněčné dělení je nezbytné pro udržení homeostázy tkání, zároveň jsou však jeho defekty úzce spjaty s rozvojem řady onemocnění včetně nádorů a předčasného stárnutí. Aktivace onkogenů vede k replikačnímu stresu a přímo ohrožuje stabilitu genomu. Důležitým mechanismem pro ochranu integrity genomu je správná kontrola přechodu mezi interfází a mitózou. Jaderné dělení je umožněno jen buňkám, ve kterých došlo k bezchybnému zdvojení genetické informace. Naopak buňky s poškozenou strukturou DNA zůstávají dočasně či trvale zastaveny v G2 fázi buněčného cyklu. Předmětem této bakalářské práce je podrobná literární rešerše na téma molekulárních mechanismů regulace G2/M přechodu za normálních podmínek a za přítomnosti poškození DNA.
|
|
|
Characterisation of the mechanisms regulating 53BP1 nuclear transport
Liďák, Tomáš ; Macůrek, Libor (vedoucí práce) ; Brábek, Jan (oponent)
Protein 53BP1 se významně podílí na buněčné odpovědi na poškození DNA a udržování integrity genomu. Nedávno bylo popsáno, že je transportován do jádra prostřednictvím importinu ß. Cílem této práce bylo identifikovat jaderný lokalizační signál proteinu 53BP1, a to s využitím metod fluorescenční mikroskopie a imunoprecipitace. Získané výsledky ukázaly, že protein 53BP1 váže importin ß prostřednictvím svých dvou úseků bohatých na bazické aminokyseliny (1667-KRK-1669 a 1681-KRGRK- 1685). Tyto úseky byly rovněž nutné pro jeho vstup do jádra. Krátký polypeptid zahrnující tyto dva úseky vázal importin ß a umožnil transport GFP do jádra. Dále jsem se zaměřil na testování vlivu fosforylace serínu 1678 na transport proteinu 53BP1 do jádra. Mutanta 53BP1-S1678D, která mimikuje fosforylovaný serín na pozici 1678, měla výrazně sníženou schopnost vázat importin ß a byla hůře transportována do jádra. Nicméně žádné změny v transportu proteinu 53BP1 do jádra nebyly pozorovány, a tak se zdá, že fosforylace serínu 1678 cyklin-dependentními kinázami nebude významně regulovat jeho transport. Závěrem lze konstatovat, že protein 53BP1 má klasický bipartitní jaderný lokalizační signál. I když se transport proteinu 53BP1 do jádra nezdá být regulován v průběhu buněčného cyklu, může být regulován v odpovědi na jiné podněty....
|
|
|
Role Polo-like kináz v regulaci buněčného cyklu a odpovědi na poškození DNA
Kudláčková, Radmila ; Macůrek, Libor (vedoucí práce) ; Šolc, Petr (oponent)
Při každém buněčném dělení musí dojít k rovnoměrnému rozdělení genetického materiálu do obou dceřiných buněk. V další fázi se musí chybějící část genomu dosyntetizovat. Celý cyklus podléhá regulaci ze strany cyklin-dependentních kináz (Cdk) ve spolupráci s cykliny. Dojde-li v průběhu buněčného cyklu k poškození DNA, signální dráhy kontrolních bodů potlačí průběh cyklem a zajistí, aby se buňka nedělila, dokud nebude zjednána náprava. Pokud kontrolní body neplní svoji funkci, dochází k nádorovému bujení. Polo-like kinázy (Plk) jsou stejně jako Cdk důležitými regulátory buněčného cyklu. Plní řadu funkcí především v mitóze, ale i v odpovědi na DNA poškození. Tato práce je zaměřena zejména na lidské homology, nicméně konzervovanost homologů mezi organismy je značná, tudíž uvedené poznatky mají obecnější platnost. Lidské buňky exprimují pět proteinů z rodiny Polo-like kináz, z nichž Plk1 odpovídá Polo-like kinázám nižších eukaryot. Poznatky o ostatních čtyřech kinázách jsou teprve na vzestupu.
|
|
|
Wnt signaling in intestinal homeostasis and tumorigenesis
Janečková, Lucie ; Kořínek, Vladimír (vedoucí práce) ; Macůrek, Libor (oponent) ; Truksa, Jaroslav (oponent)
Kanonická signální dráha Wnt je jednou z nejdůležitějších drah řídících buněčnou proliferaci a diferenciaci. Je evolučně vysoce konzervovaná a hraje důležitou roli nejen během embryonálního vývoje, ale také v obnově tkání v dospělém organismu. Naopak nefyziologická aktivace této dráhy Wnt způsobuje vznik různých typů lidských onemocnění. Ve střevě je signalizace Wnt úzce spojena s regulací životního cyklu a dělením střevních kmenových buněk a s celkovou obnovou střevního epitelu. Konstitutivní aktivace signální dráhy Wnt vedoucí k rozvoji neoplázie a nádorů stojí za naprostou většinou případů rakoviny tlustého střeva, která je třetím nejčastějším nádorovým onemocněním v rozvinutých částech světa. Cílem této práce bylo odhalit nové aspekty regulačních mechanismů signální kaskády Wnt a také nalézt nové specifické inhibitory této dráhy včetně potvrzení jejich účinku v pokusných myších. Výsledky práce jsou shrnuty ve čtyřech publikacích. První studie se zabývá buněčným zpracováním a posttranslačními modifikacemi myších proteinů Wnt. Tyto procesy jsou nezbytné pro sekreci těchto bílkovin z buňky a jejich následnou signální aktivitu. Další publikace je zaměřená na gen Troy, který jsme popsali jako inhibitor signalizace Wnt. TROY je cílovým genem dráhy Wnt, který byl identifikován chromatinovou...
|
|
|
53BP1 a jeho role v buněčné odpovědi na dvouvláknové zlomy DNA
Liďák, Tomáš ; Macůrek, Libor (vedoucí práce) ; Rösel, Daniel (oponent)
Poškození genetické informace uložené v molekulách DNA podmiňuje řadu patologických stavů včetně nádorového bujení a stárnutí. Evolučně konzervované mechanismy opravy DNA brání nahromadění mutací a rozvoji genomové nestability. 53BP1 (tumor suppressor p53-binding protein 1) je důležitý regulátor buněčné odpovědi na dvouvláknové zlomy DNA, který se po vystavení buňky ionizujícímu záření stává součástí fokusů obklopujících vzniklé zlomy DNA. Funkce 53BP1 v buněčné odpovědi na poškození DNA byly objasněny až v nedávně době. Zatímco v drahách signalizujících vznik dvouvláknových zlomů kontrolním bodům buněčného cyklu hraje 53BP1 jen nepatrnou roli, ukázal se být nepostradatelný při určování typu opravy části těchto zlomů. Opravy DNA jsou ovlivněny 53BP1 v několika případech. Kontroluje resekci konců DNA, umožňuje opravy DNA v heterochromatinu, zvyšuje mobilitu nechráněných telomer a zprostředkovává synapse konců DNA během V(D)J rekombinace a izotypového přesmyku. 53BP1 negativně ovlivňuje opravu DNA v nádorových buňkách s poškozeným BRCA1 (breast cancer type 1 susceptibility protein), což může mít vliv na terapeutickou odpověď u některých nádorů prsu. Cílem této bakalářské práce je shrnout nové poznatky o roli 53BP1 v buněčné odpovědi na dvouvláknové zlomy DNA. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
|
|
|
The functional in vitro analysis of the BRCA1alternative splicing variants
Ševčík, Jan ; Kleibl, Zdeněk (vedoucí práce) ; Stopka, Tomáš (oponent) ; Macůrek, Libor (oponent)
Úvod: Inaktivace tumor supresorového genu BRCA1 je predispozičním faktorem vzniku karcinomu prsu a ovaria. Vznik funkčně odlišných nádorově specifických alternativních sestřihových variant může být možným mechanismem snižujícím aktivitu BRCA1 v procesu reparace dvouřetězcových zlomů DNA (DDSB). V této práci jsme funkčně charakterizovali dvě alternativní sestřihové varianty BRCA114-15 a BRCA117-19, nalezené v průběhu genetického screeningu jedinců s vysokým rizikem vzniku karcinomu prsu.Metody: Pro funkční in vitro analýzu jsme vytvořili modelový systém klonů buněčné linie MCF-7 stabilně exprimujících zkoumané varianty. Pomocí comet assay a konfokální imunomikroskopie jsme v tomto systému sledovali vliv BRCA114-15 a 17-19 variant na kinetiku reparace DDSB a proliferaci. Aktivita DNA reparačních procesů byla stanovena přímo pomocí in vitro NHEJ assay a nepřímo testem senzitivity na mitomycin C. Proliferační aktivita byla stanovena klonogenním testem a růstovými křivkami. Výsledky: Exprese BRCA114-15 a 17-19 zvyšuje v MCF-7 buňkách úroveň endogenního poškození DNA, zpomaluje reparaci DDSB, negativně ovlivňuje tvorbu reparačních komplexů v počáteční fázi reparace a prodlužuje jejich trvání. Varianty BRCA114-15 a 17-19 rozdílně ovlivňují aktivitu HR, NHEJ a radiosensitivitu MCF-7 buněk. Závěr: Zvýšení exprese...
|
|
|
Molecular mechanisms of checkpoint signalling and termination
Benada, Jan ; Macůrek, Libor (vedoucí práce) ; Brábek, Jan (oponent) ; Truksa, Jaroslav (oponent)
Pro udržení integrity genomu využívají buňky extensivní signální síť nazývanou buněčná odpověď na poškození DNA (DNA damage response). DDR je schopná aktivovat kontrolní body buněčného cyklu (checkpoints), které brání dalšímu průchodu buněčným cyklem a umožňují buňce opravit poškozenou DNA. Poruchy těchto ochranných mechanismů se projevují závažnými lidskými onemocněními, především rozvojem rakoviny. Cílem teto práce je přispět k porozumění toho jak buňky negativně regulují DDR a signalizaci kontrolních bodu buněčného cyklu. Zaměřili jsme se zejména na fosfatázu Wip1 (PPM1D), která je hlavním negativním regulátorem DDR a je nezbytná pro zotavení z kontrolních bodu. Nejprve jsme ukázali, že Wip1 je degradovaná během mitózy APC- Cdc20-dependetním mechanismem. Wip1 je dále v průběhu mitózy fosforylována na několika aminokyselinách, což vede k inhibici její enzymatické aktivity. Navrhujeme, že inhibice Wip1 umožňuje buňkám adekvátně reagovat i na nízkou hladinu poškození DNA, ke kterému dochází i při nenarušené mitóze. V následující publikaci jsme se zabývali tím, proč mitotické buňky spouštějí pouze časnou DDR a nepokračují k akumulaci opravných faktoru jako je 53BP1. Ukázali jsme, že 53BP1 je fosforylován kinázami CDK1 a Plk1 uvnitř motivu, který je zodpovědný za jeho vazbu na ubiquitin. Tyto...
|
|
| |
|
| |
host ::
RSS.