|
| |
|
|
RNA polymerase: The "meeting point" of regulatory networks
Wiedermannová, Jana ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Pospíšek, Martin (oponent) ; Valášek, Leoš (oponent)
Bakteriální RNA polymeráza (RNAP) je proteinový komplex nepostradatelný pro přepis DNA do RNA. Jakožto klíčový enzym zodpovědný za regulaci genové exprese shromažďuje signály z buňky a reaguje na ně přesným nastavením úrovně transkripce jednotlivých genů. Tento proces ovlivňují jak vlastní podjednotky RNAP tak i další transkripční faktory (TF), které přímo nebo nepřímo interagují s RNAP. Cílem této disertace bylo prohloubit znalosti o komplexitě transkripční regulační sítě a o provázanosti jejích jednotlivých nitek, které jsou stále objevovány. Hlavním tématem této PhD práce je protein HelD, nově objevený vazebný partner RNAP z bakterie Bacillus subtilis. Ukázali jsme, že HelD se váže mezi sekundární kanál RNA polymerázy a alfa podjednotky tohoto enzymu. HelD se váže na RNAP ve formě jádra (bez přítomnosti sigma faktoru). Dokázali jsme, že HelD stimuluje transkripci v závislosti na ATP tím, že napomáhá jejímu cyklování a elongaci. Stimulační efekt proteinu HelD je násoben působením podjednotky delta, malé podjednotky RNA polymerázy specifické pro gram positivní (G+) bakterie. Tento fakt odhalil nové vztahy v provázanosti komplikované transkripční sítě. Další dvě publikace této práce pojednávají o vlastní delta podjednotce. Pomocí nukleární magnetické rezonance (NMR) jsme vyřešili 3D strukturu a...
|
|
|
Vývoj chemických regulátorů drah mikroRNA a RNAi
Bruštíková, Kateřina ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent) ; Pospíšek, Martin (oponent)
MikroRNA jsou nekódující RNA navozující sekvenčně specifickou inhibici genové exprese na posttranskripční úrovni. MikroRNA představují hlavní skupinu malých endogenních RNA v savčích buňkách. V současnosti je známo více než 2500 lidských mikroRNA, které potencionálně regulují více než 60% lidských genů kódujících proteiny. MikroRNA se účastní většiny buněčných procesů a změny v jejich expresi byly popsány u různých patologií, včetně rakoviny. V současnosti neexistuje žádná malá chemická sloučenina schopná efektivního ovlivnění aktivity dráhy mikroRNA. Nicméně, malé chemické sloučeniny představují skvělé nástroje pro výzkum procesů, ve kterých dráhy sekvenčně specifického umlčování RNA (RNA silencing) hrají roli. Navíc by mohly být využitelné i pro biotechnologické aplikace a mohly by mít i značný terapeutický potenciál. Tato práce je součástí širokého projektu, jehož konečným cílem je: (i) najít soubor malých molekul umožňujících stimulaci a inhibici drah sekvenčně specifického umlčování RNA a (ii) identifikovat případy, kdy se tyto dráhy vzájemně ovlivňují s jiných buněčnými drahami. Tato práce shrnuje výsledky prvních dvou fází projektu, vývoj vysoce výkonných metod testování s vysokou propustností a vysoce výkonné testování s vysokou propustností (high-throughput screening, HTS) dostupných...
|
|
|
Substrate cleavage by mammalian Dicer isoforms
Kubíková, Jana ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Pospíšek, Martin (oponent)
Hostitelské organismy vyvinuly řadu antivirových odpovědí, které rozpoznávají a potlačují virovou infekci. Jedním ze znaků virové infekce je i přítomnost dvouvláknové RNA v buňce. Jedna z drah odpovídajících na dvouvláknovou RNA je RNA interference, která představuje klíčovou složku antivirové obrany u bezobratlých živočichů a rostlin. Savci využívají pro obranu před viry odlišnou dráhu, která rozpoznává dvouvláknovou RNA, nazývající se interferonová odpověd. RNA interference funguje jen v savčích oocytech a raných embryonálních stádiích, ačkoliv potřebné enzymové vybavení se nachází ve všech somatických buňkách, protože je využíváno mikroRNA dráhou. Předchozí studie ukázala, že funkčnost RNA interference v myších oocytech souvisí s přítomností oocytární isoformy Diceru (DicerO ), jež je zkrácená na N-konci. V této práci jsem se zaměřila na zhodnocení, zda DicerO zpracovává substráty typické pro RNA interferenci účinněji než nezkrácená isoforma Diceru (DicerS ), která se nachází v somatických buňkách. Za tímto účelem jsem vyvinula protokol na purifikaci Diceru, abych získala obě myší isoformy Diceru o vysoké čistotě. Následně jsem otestovala jejich aktivitu v neradioaktivní enzymové analýze na různých substrátech se strukturními prvky charakteristickými pro substráty RNA interference. Získané výsledky...
|
|
|
Příprava kvasinkového systému pro studium lidské iniciace translace
Holásková, Lucie ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Cuchalová, Lucie (oponent)
Iniciace translace je vysoce regulovaný proces. Významnou roli v něm hraje komplex eIF4F, který se skládá z 3 podjednotek - eIF4A, eIF4E a eIF4G. Protein eIF4E se váže na 7-methylguanozinovou čepičku na 5' konci mRNA, helikáza eIF4A rozvolňuje sekundární struktury na mRNA a kostru tvoří protein eIF4G. Spolupráce s dalšími iniciačními faktory je důležitá pro zahájení tvorby proteinů. Cílem mé práce bylo přispět k vytvoření kvasinkového kmene Saccharomyces cerevisiae s humanizovaným eIF4F faktorem. Nejprve jsem nahradila protein eIF4E kvasinky Saccharomyces cerevisiae za lidský protein eIF4E. S využitím delečních kazet a cre/loxP rekombinace jsem připravila kmeny s delecemi v genech eIF4GI (huΔ4G1) a eIF4GII (huΔ4G2). Charakterizace nově získaných kmenů překvapivě ukázala, že lidský eIF4E protein nahrazuje odpovídající kvasinkový orthologní faktor lépe než eIF4E z evolučně výrazně bližší Candida albicans. Pilotní pokusy s nově získanými kmeny a s kmeny závislými na eIF4E z Candida albicans též ukázaly na možný význam kvasinkového eIF4GII pro růst buněk během teplotního a osmotického stresu. Klíčová slova: iniciace translace, eIF4E, eIF4G, Saccharomyces cerevisiae
|
|
|
Vliv modifikací rRNA na syntézu proteinů
Kročová, Eliška ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Holá, Dana (oponent)
Ribosom je supramolekulární útvar, který zprostředkovává syntézu veškerých buněčných proteinů a je tedy nezbytný pro její život. To, že jsou některé nukleotidy ribosomální RNA modifikovány je známo už čtyřicet let. Teprve v dnešní době se však daří hlouběji studovat, jak jsou jednotlivé modifikace syntetizovány i to, jaký je jejich vliv na vznik a funkci ribosomu. Některé konkrétní nukleotidové modifikace mají význam při vzniku ribosomu (například m1 acp3 Ψ1191 SSU), u některých byl pozorován vliv na správnou funkčnost ribosomu (například Um2921, Gm2922, Ψ2923 LSU, m1 acp3 Ψ1191 SSU). Většina modifikovaných nukleotidů v eukaryotní rRNA je rozpoznávána malými jadérkovými RNA (snoRNA). Několik málo nukleotidů je však rozpoznáváno a následně modifikováno specifickými proteiny. Tyto proteiny hrají i zásadní roli ve zrání ribosomu. Předložená práce přehledně shrnuje současné znalosti o úloze nukleotidových modifikací v ribosomální RNA při vzniku, zrání a funkci ribosomu.
|
|
| |
|
|
Protein synthesis in cellular stress
Cienciala, Martin ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Holá, Dana (oponent)
Mnoho organizmů z různých větví života se často potýká s buněčným stresem zapříčiněným podmíkami vnějšího prostředí. Pro boj s těmito nepříznivými podmínkami se vyvinulo mnoho komplexních mechanismů. Kvasinka Saccharomyces cerevisiae je obzvláště dobře vybavená pro eliminaci negativních účinků oxidativního nebo osmotického stresu. Tyto podmínky zpravidla vedou k zastavení produkce proteinů. Kináza GCN2 se považuje za hlavního zprostředkovatele této odpovědi. Zastavení produkce proteinů je také doprovázeno vyšší expresí proteinů, podílejících se na boji se stresem. Tvorbě těchto proteinů předchází sada specializovaných regulačních procesů, fungujících na různých stupních proteinové exprese. Tato práce se pokusí přednést rozmanitost a komplexitu jednotlivých úrovní této regulace.
|
|
|
Role signální dráhy HOG MAPK při osmotickém stresu u Saccharomyces cerevisiae
Vrbová, Michaela ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Janderová, Blanka (oponent)
THE ROLE OF HOG MAPK SIGNALING PATHWAY DURING OSMOTIC STRESS IN SACCHAROMYCES CEREVISIAE Budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) cells utilize a conserved mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling cascade (the high- osmolarity glycerol or HOG pathway) during conditions of increased external osmolarity. It evokes cellular responses necessary to permit continued growth. Activation of HOG pathway with Hog1 MAP kinase results in production of glycerol to prevent dehydration and up regulation of other Hog1 dependent genes because of cell adaptation. We were trying to find difference in translation between wild-type cells and two mutants of hog1 gene before and after 0,4 M NaCl osmotic stress (2, 6, 30 min). We used deletion mutant hog1Δ and hog1-as mutant with point mutation which allows inhibition of Hog1 MAPK during presence of specific AS inhibitor. We tested AS inhibitor by plate test and have found optimal concentration of 5 μM for blocking Hog1 MAPK in hog1-as mutant. Translation profiling proves that osmotic stress decreases translation in general. Hog1Δ mutant and hog1-as AS inhibited mutant behave similarly and their translation recovers slower than the wild-type's. That confirms that HOG1 gene is important for cell recovery from the osmotic stress. Microarray analysis shows that Hog1 dependent...
|
|
|
Role of the oncogenic microRNAs miR-17-92 and miR-155 in the regulation of hematopoietic differentiation and leukemogenesis
Pospíšil, Vít ; Stopka, Tomáš (vedoucí práce) ; Pospíšek, Martin (oponent) ; Machová Poláková, Kateřina (oponent)
Krvetvorba je vysoce uspořádaný hierarchický proces, ve kterém je diferenciace specializovaných krevních buněk závislá na koordinované regulaci genové exprese dvěmi klíčovými regulátory: transkripčními faktory a mikroRNA. PU.1 je základní transkripční faktor nezbytný pro vývoj a diferenciaci kmenových a progenitorových buněk do myeloidní a lymfoidní krevní řady. MikroRNA jsou nekódující ~22 nukleotidů dlouhé RNA, jež regulují posttranskripčně genovou expresi vazbou do nepřekládané oblasti mRNA a tím způsobují umlčení translace. Předložená disertační práce popisuje nové mechanismy vzájemné regulace a funkce onkogenních mikroRNA, miR-17-92 klastru a miR-155 a transkripčních faktorů PU.1 a Egr2, účastnících se makrofágové diferenciace myeloidních progenitorů. MiR-17-92 (Onkomir1) kóduje sedm příbuzných mikroRNA, které regulují buněčnou proliferaci, apoptózu a vývoj, které jsou nadprodukovány v nádorových buňkách myeloidních leukemií a dalších malignit. Tato práce popisuje nový mechanismu regulace miR-17-92 klastru v myeloidních progenitorech. V průběhu makrofágové diferenciace transkripční faktor PU.1 indukuje expresi sekundárního transkripčního faktoru Egr2. Ten se váže do CpG ostrůvku v promotorové oblasti miR-17-92 klastru a současně přináší protein Jarid1b, histon demetylázu, jež demetyluje...
|
host ::
RSS.