|
|
Role of translational elongation factors in dynamics of stress granules.
Hlaváček, Adam ; Hašek, Jiří (vedoucí práce) ; Janderová, Blanka (oponent)
Translační faktor eIF5A se pravděpodobně podílí na iniciaci i elongaci. Existují také zmínky o jeho roli v tvorbě P-bodies. Vzhledem k podobnosti P-bodies a stressových granulí (SGs) jsme se rozhodli otestovat roli eIF5A v dynamice teplem-navozených SGs a jeho důsledky pro zotavení buněk. Pro hodnocení funkce eIF5A v tvorbě SGs byla použita teplotně citlivá (ts) mutanta eIF5A-3 (C39Y/G188D) kultivovaná za permisivní teploty 25řC, s Rpg1-GFP fúzním proteinem jako značkou SGs. Buňky byly vystaveny robustnímu tepelnému šoku 46řC po 10 minut. Schopnost mutovaných buněk přežít byla testována propidium iodidovým barvením a výsevem jednotek tvořících kolonie (CFU). Zjistili jsme, že mutanta eIF5A-3 tvoří teplem navozené SGs, které agregují volněji. To naznačuje, že pro skládání SGs je nutný plně funkční eIF5A. Nicméně mutace nejeví dopad na míru rozpouštění SGs. Testy přežívání ukazují, že mutanta eIF5A-3 je citlivá vůči buněčné smrti obdobně jako WT buňky, avšak její schopnost znovu nastolit proliferaci je znatelně lepší. Pozorovali jsme také ztrátu ts fenotypu eIF5A-3 mutanty. Tyto změny vlastností nebyly způsobeny zpětnou změnou mutované sekvence genů pro eIF5A. Jejich pravděpodobná příčina leží v adaptivní evoluci. Naše výsledky také naznačují účast eIF5A v aktinové dynamice. Navrhujeme, že účast eIF5A v...
|
|
|
Function and localization of the SUN family of proteins in yeast populations
Kuznetsov, Evgeny ; Palková, Zdena (vedoucí práce) ; Janderová, Blanka (oponent) ; Malcová, Ivana (oponent)
Rodina SUN proteinů (Uth1p, Sun4p, Sim1p, Nca3p) je skupina proteinů vyskytujicích v houbach a podobných glucanazům bunečny steny. SUN proteiny mají vysokou homologie v jejich C-terminalní doméně která je 256 aminokyselin dlouhá. Naše předchozí studium vývoje kvasinkových koloní odhalilo, že členy rodiny SUN proteinů mohou byt zapojený do procesu stárnutí a také mohou hrát důležitou roli pro přežívaní během vývoje a růstu mnohobunečné kvasinkové populace. V naší laboratoři jsme provedli microarray analýzu změn expresí genů v koloních, ktera ukázala výrazné změny v urovni exprese člena SUN rodiny UTH1. Kmen s deletovaným UTH1 genem vykazuje zpomalenější růst a horší přeživaní v kvasinkových koloních při porovnaní s wild type kmenem. Nicméně v své práci jsem se soustředil na identifikaci a ziskaní vice informací o funkcích jednotlivych SUN proteinů a zjištění jejich přesné lokalizace. Je zajimavé, že nekteré SUN proteiny mají duální lokalizaci (Uth1p a Sun4p) v mitochondrích a buněčné stěně a mohou byt spojeny s jejich funkcí. V této disertační práci, kapitola "Results and discussion" byla rozdělena na dvě části: první adresovaná otázkám, které se týkají lokalizace, regulaci zavislé na kysliku a možne zapojení SUN proteinů v remodelaci buněčné stěny. Druhé časti předcházel vývoj nové metody...
|
|
|
Cílené vyhledávání genů sekundárního metabolismu ve streptomycetách.
Bakal, Tomáš ; Najmanová, Lucie (vedoucí práce) ; Janderová, Blanka (oponent)
Objevy nových přírodních antibiotik jsou dnes již vzácností, proto se jako velmi perspektivní možnost zisku nových antibiotik a látek se zajímavou biologickou aktivitou jeví konstrukce kmenů produkujících hybridní látky. Tato práce je součástí širšího projektu zaměřeného na přípravu nových biologicky aktivních látek odvozených od antibiotika linkomycinu. Linkomycin se skládá z cukerné (MTL) a aminokyselinové (kyselina propylhygrová) složky spojených peptidovou vazbou. Je známo, že nejrůznější modifikace aminokyselinové části molekuly, zvláště pak bočního alkylového řetízku, vedou ke zlepšení antibiotických vlastností výsledné látky. Úzkým hrdlem syntézy takto modifikovaných látek je kondenzační enzym NDL-syntetáza a především jeho A-doména, která, stejně jako u nonribozomálních peptidových syntetáz (NRPS), specificky rozpoznává a aktivuje aminokyselinový prekurzor. V rámci této práce byla navržena sada degenerovaných primerů pro vyhledávání A-domén NRPS metodou PCR a byly optimalizovány podmínky reakce. Zdrojem genetické informace pro vyhledávání zajímavých A-domén NRPS, použitelných pro konstrukci hybridních biosyntetických shluků, bude v první fázi sbírka cca 800 půdních izolátů aktinomycet. Kmeny této sbírky byly charakterizovány taxonomicky (sekvenace 16S rDNA) a sbírka byla utříděna (byly vyloučeny...
|
|
|
Příprava a charakterizace proteinu LmbX zúčastněného v biosyntéze antibiotika linkomycinu
Jiráčková, Petra ; Janata, Jiří (vedoucí práce) ; Janderová, Blanka (oponent)
Linkomycin je antibiotikum využívané v klinické praxi. Jeho producentem je Streptomyces lincolnensis. Linkomycin se skládá z aminocukerné a aminokyselinové složky, které jsou spojeny amidovou vazbou. Aminokyselinovým prekurzorem je propylprolin (PPL), jehož biosyntéza probíhá dráhou vycházející z tyrosinu. Modifikovaná PPL dráha byla také objevena u pyrrolobenzodiazepinů (PBD) a hormaomycinu. V biosyntéze PBD je PPL prekuzor dále modifikován reakcemi katalyzovanými specifickými enzymy nepřítomnými v biosyntéze linkomycinu. Geny kódující tyto enzymy by mohly být přeneseny do genového shluku pro biosyntézu linkomycinu. Tímto způsobem bychom mohli získat producenty hybridních antibiotik s lepšími vlastnostmi, a dokonce antimalarickými účinky. PPL dráhy se účastní šest enzymů, které jsou kódovány v genovém shluku pro biosyntézu linkomycinu. První dvě reakce biosyntézy PPL byly již prokázány, proto se tato práce zaměřuje na reakci třetí, kterou by měl podle literatury katalyzovat protein LmbX. Jeho předpokládaná funkce v biosyntéze PPL je hydrolýza C-C vazby. Podle sekvenční homologie však protein LmbX patří do rodiny isomeras. V této práci byl nadprodukován protein LmbX a byla testována jeho aktivita v přítomnosti předpokládaného substrátu. Produkty byly měřeny na kapalinovém chromatografu (UHPLC)....
|
|
|
Role proteinu Prp45 v expresi a zrání mRNA
Abrhámová, Kateřina ; Půta, František (vedoucí práce) ; Pichová, Alena (oponent) ; Janderová, Blanka (oponent)
Souhrn Prp45p ze Saccharomyces cerevisiae a Snw1p ze Schizosaccharomyces pombe jsou pro eukaryotní buňku nepostradatelné proteiny, které vykazují vysoký stupeň homologie se savčím transkripčním regulátorem a nestřihovým faktorem SNW/SKIP. Analyzovali jsme esenciální funkci těchto proteinů v obou kvasinkách a nalezli mutaci (prp45(1-169)), která u mutantního kmen s odpovídající chromozomální delecí způsobuje citlivost vůči vyšší kultivační teplotě a hypersenzitivitu vůči cykloheximidu, hydroxymočovině, látce calcofluor white a inhibitorům polymerizace mikrotubulů. Při kultivaci ve 30řC jsou tyto kvasinky často prodloužené, deformované a větší než wt. Po synchronizaci ve 37řC zastavují kvasinky prp45(1-169) svůj růst s dvojnásobným obsahem DNA. Zjistili jsme, že teplotní senzitivita kmene prp45(1-169) není překonána a hypersenzitivita vůči mitotickým jedům je jen částečně potlačena odstraněním intronu z genu TUB1. To odlišuje prp45(1-169) od těch mutant v sestřihových faktorech, jež vykazují na tubulinu závislý blok v G2/M fázi, který může být překonán pomocí verze tub1 bez intronu . Pomocí analýzysestřihu in vitro jsme zjistili, že sestřih optimálních substrátů není narušen. Porovnávali jsme stabilitu a obsah RNA mezi prp45(1-169) a wt kvasinkami při různých teplotách pomocí microarray analýzy. Expresi a...
|
|
|
Produkce amoniaku koloniemi mutantů a stárnutí strukturovaných kolonií Saccharomyces cerevisiae
Nedbálková, Jana ; Heidingsfeld, Olga (oponent) ; Janderová, Blanka (vedoucí práce)
Produkce amoniaku koloniemi mutantů a stárnutí strukturovaných kolonií Saccharomyces cerevisiae Cílem této diplomové práce je sledovat vývoj, respektive stárnutí buněk v kvasinkových koloniích Saccharomyces cerevisiae. Kvasinkové buňky S. cerevisiae tvoří na pevném substrátu mnohobuněčné organizované struktury - kolonie, ve kterých dochází k mezibuněčným interakcím. Tyto interakce mají vliv na formování, morfologii a stárnutí kvasinkové kolonie. Tato práce je zaměřena na změny v produkci amoniaku obřími koloniemi delečních mutant, a také na stárnutí kolonií se zvrásněnou morfologií. Charakterizovala jsem mutantní kmeny S. cerevisiae, s delecí v genech RTG1, RTG2, RTG3, FIS1, CIT2, jejichž produkty hrají významnou roli ve vývoji kolonie. Transkripce těchto genů se mění v průběhu vývoje kolonií při přechodu z acidické do alkalické fáze. Zjistila jsem, že míra produkce amoniaku byla ve shodě s výsledky alkalizace média v okolí obřích kolonií a že uvedené mutanty odvozené od kmene BY produkovaly amoniak od 15. dne. Míra produkce amoniaku koloniemi kmene rtg3∆ byla srovnatelná s rodičovským kmenem, nižší produkce oproti rodičovskému kmeni byla zjištěna u fis1∆, rtg1∆ a rtg2∆. Naopak u kmene cit2 byla produkce amoniaku vyšší-než u rodičovského kmene. Připravila jsem kmeny S. cerevisiae ƩSh , u kterých jsem pomocí...
|
|
|
Využití kvasinek ve vývoji nových antivirotik
Dubská, Jitka ; Janderová, Blanka (oponent) ; Mašek, Tomáš (vedoucí práce)
The increase of infectious chronic diseases is the main health problem of modern civilization. These diseases, which are spread both in developing as well as industrial countries, cause more than 59% of all life ends. Statistically, the most frequent infection is hepatitis C virus (HCV) infection. Incurable hepatic illnesses such as cirrhosis and hepatocellular carcinoma are the outcomes of the HCV infection and the liver transplantation is the only successful therapeutic option for the patients in industrial countries. It is estimated that about 170 million people worldwide are chronically infected with this virus. HCV is a small coated virus with single stranded RNA genome of positive polarity. Lots of research has been done since it was discovered twenty years ago but the efficient drug is still missing. There is a strong tendency to focus the research on searching for translation initiation inhibitors in last few years, because the whole life cycle of HCV, including RNA replication, new virions assembly etc., is dependent on translation products. Nowadays there is a small group of human proteins (so called ITAFs) known for up- or down-regulate HCV and other viruses translation initiation. It is believed, that this group is much more comprehensive. The aim of this diploma work was to construct yeast...
|
|
| |
|
|
Úloha transportních systémů pro draselné kationty ve fyziologii kvasinky Saccharomyces cerevisiae
Marešová, Lydie ; Sychrová, Hana (vedoucí práce) ; Pácha, Jiří (oponent) ; Janderová, Blanka (oponent)
V rámci této disertační práce se podařilo objasnit některé dříve publikované nesrovnalosti (Ramírez et al., 1998) v souvislosti s domnělým K+/H antiporterem plasmatické membrány kvasinky S cerevisiae. Bylo prokázáno, že Kha I p nezprostředkovává transport draselných kationtů z buněk přes plasmatickou membránu a že mutanty s delecí khal nemají změněný vnitorbuněčný obsah K+ ani zvýšený membránový potenciál. Byly nalezeny a ověřeny nové fenotypy delece khal (citlivost k zvýšenému pH růstového média a k hygromycinu B) což (1) napovídá o funkci proteinu Kha l v regulaci vnitrobuně čného a vnitroorganelového pH a následně v regulaci homeostáze kationtů alkalických kovů v cytosolu a uvnitř buněčných organel; a (2) umožňuje heterologní xpresi a charakterizaci příbuzných proteinů z vyšších eukaryot v S cerevisiae. První z nich, protein Chx 17 z A. thaliana, byl v delečních mutantech exprimován a ukázalo se, že je schopen komplementovat fenotypové projevy delece khal, takže jeho role v buňkách A. thaliana by mohla být podobná funkci proteinu Kha 1 v S. cerevisiae. Jeden z vytyčenýc h cílů disertační práce se nepodařilo splnit docela: Bylo sice správně určeno, že protein Khal není lokalizován v plasmatické membráně kvasinky, a jeho lokalizace byla odhadnuta do membrány Golgiho aparátu, než se však podařilo nalézt...
|
|
|
Diferenciace kolonií kvasinek a vývoj nových přístupů pro monitorování dostupnosti kyslíku a přítomnosti živin.
Vopálenská, Irena ; Janderová, Blanka (vedoucí práce) ; Demnerová, Kateřina (oponent) ; Pichová, Iva (oponent)
Kvasinka Saccharomyces cerevisiae jako jednobuněčný organizmus patří mezi nejstudovanější experimentální organizmy. Je důležitým modelovým organizmem pro studium intracelulárních procesů v eukaryotických buňkách. Ovšem kvasinky jsou rovněž sociální organizmy schopné mezibuněčné komunikace a tvorby organizovaných mnohobuněčných struktur (kolonií a biofilmů). Kvasinky stejně jako další mikroorganizmy při růstu v přírodě upřednostňují tvorbu organizovaných mnohobuněčných struktur na pevných površích před růstem v planktonní formě, tedy jako individuální buňky (Palková, 2004; Wimpenny, 2009). Pro kvasinku S. cerevisiae je typická tvorba kolonií, biofilmy byly popsány jen výjimečně. Kvasinkové kolonie se vyznačují rozmanitými morfologiemi, které jsou pro různé kmeny charakteristické (Kocková-Kratochvílová, 1982). Tato práce se zabývá morfologií a diferenciací kolonií S. cerevisiae běžných laboratorních kmenů, tvořících málo strukturované kolonie, a kmenů s genetickým pozadím Σ1278b, tvořících vysoce strukturované "vrásčité" kolonie. Ukazuje, že polarizovaný typ pučení a zejména schopnost buněk tvořit agregáty umožňují vznik strukturované morfologie. Při vývoji "vrásčitých" kolonií dochází ke dvěma rozdílně regulovaným dimorfním přeměnám kvasinkových buněk na pseudohyfální růst; při jedné z nich se uplatňuje...
|
host ::
RSS.