|
| |
|
| |
|
| |
|
|
Quantitative aspects of mitochondrial genome in cancer and diabetes
Alán, Lukáš ; Ježek, Petr (vedoucí práce) ; Teisinger, Jan (oponent) ; Modrianský, Martin (oponent)
Mitochondrie se původně vyvinuly z alfa-proteobakteriálního předka a nyní fungují v eukaryotických buňkách jako hlavní zdroj energie, tedy ATP. Jsou to semiautonomní organely s vlastní DNA, která nese genetickou informaci pro 13 proteinů oxidativní fosforylace, 22 transferových RNA a dvě ribosomální RNA. Za normálních podmínek tvoří mitochondrie síť tubulů, které mohou mezi sebou rovnovážně fúzovat a zase se rozpadat. Mitochondriální poruchy jsou velmi heterogenní skupinou nemocí, které je obtížné jak diagnostikovat, tak léčit. To je dáno především složitostí mitochondriální genetiky, která musí kombinovat produkty dvou genomů, složitostí mitochondriální architektury a stále ještě nedostatečnou úrovní dnešního poznání. V této práci byly zavedeny metody vizualizace mitochondriální sítě, nukleoidů, mitochondriální DNA (mtDNA) různých typů mtRNA a metody pro kvantifikaci mtRNA a mtDNA. Tyto metody byly použity k detekci kvality mitochondriálních nukleových kyselin. Měřili jsme úroveň rozpadu mitochondriální sítě, distribuci nukleoidů a množství mtDNA po inhibici respirace rotenonem nebo po degradaci elektrické složky proton-motivní síly valinomycinem. Na základě našich experimentů jsme vytvořili modely pro indukci dezintegrace mitochondriální sítě. Mitochondrie v kontrolních buňkách měly převážně tubulární...
|
|
|
Příprava vazebných partnerů 14-3-3 proteinů pro strukturní studie.
Kopecká, Miroslava ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Teisinger, Jan (oponent)
Tyrosinhydroxylasa patří do skupiny hydroxylas aromatických aminokyselin a katalyzuje počáteční krok biosyntézy katecholaminových neuropřenašečů. Tento enzym má homoteramerní strukturu a skládá se ze tří strukturních domén: N-koncové regulační domény, katalytické domény a C-koncové tetramerizační domény. Aktivita tyrosinhydroxylasy je regulována fosforylací a regulací na úrovni exprese. Fosforylace Ser-19 umožňuje navázání proteinu 14-3-3, které ovlivňuje strukturu regulační domény a chrání ji před její defosforylací a degradací. Struktura regulační domény je stále neznámá, proto jsme se rozhodli pro její objasnění pomocí technik nukleární magnetické rezonance. Byl optimalizován expresní a purifikační protokol regulační domény tyrosinhydroxylasy. Protein byl exprimován jako fúzní protein obsahující histidinovou kotvu na N-konci polypetidového řetězce. Purifikace se skládala ze dvou kroků: z niklové chelatační chromatografie a gelové permeační chromatografie. Dynamický rozptyl světla a 1 H-NMR spektroskopie byly využity k ověření monodisperzity proteinu a jeho možného použití pro další experimenty.
|
|
| |
|
|
Localization and characterization of binding sites for Ca2+ binding proteins and phosphatidylinositol phosphates on intracellular termini of TRP channels
Boušová, Kristýna ; Teisinger, Jan (vedoucí práce) ; Žáčková, Markéta (oponent) ; Krůšek, Jan (oponent)
Tato disertační práce pojednává o charakterizaci vazebných míst pro kalcium vázající protein S100A1 a fosfatidylinositol fosfáty na intracelulárních koncích transient receptor potential (TRP) kanálů, a to především z rodin kanonických (TRPC), vaniloidních (TRPV) a melastatinových (TRPM). TRP kanály reprezentují superrodinu důležitých zprostředkovatelů dějů, které se odehrávají především v oblasti senzorické physiologie: přispívají k detekci chuti, rovnováhy těla, zraku, sluchu, hmatu a k sensibilitě vůči teplotním a tlakovým vjemům vnějšího prostředí. Tyto kanály slouží jako specializované neselektivní a nociceptivní membránové receptory zodpovědné za modulaci sil, které řídí vstup kationtů do buňky. TRP kanály jsou tvořeny šesti transmembránovými doménami s N- a C- terminálními konci vyskytujícími se v intracelulární oblasti. Celkem čtyři monomerní jednotky tvoří charakteristické uspořádání funkčního kanálu. Bylo prokázáno, že většina členů této téměř třicetičlenné rodiny transportérů je aktivována různorodými stimuly působícími jako signální integrátory. Z nejvíce prozkoumaných intracelulárních modulátorů TRP kanálů jsou cytosolické kalcium vázající proteiny a fosfatidylinositol fosfáty (PIPs) ukotvené na vnější straně cytoplazmatické membrány. Tyto signální integrátory váží specifické domény v...
|
|
|
Studium struktury komplexu 14-3-3:fosducin.
Kacířová, Miroslava ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Teisinger, Jan (oponent)
Předkládaná diplomová práce se zabývá biofyzikální charakterizací komplexu dvou regulačních proteinů, fosducinu (Pd) a 14-3-3. Oba proteiny jsou zapojeny do regulační kaskády přenosu signálu v oční sítnici obratlovců. Pd je 33kDa protein nacházející se ve fotoreceptorových buňkách sítnice, ale také i v jiných tkáních. Za jeho hlavní funkci v oku se považuje regulace přenosu signálu jdoucího z oka k očnímu nervu, jako odpověď na ostré světlo, a to vazbou Gtβγ podjednotky heterotrimerního transducinu, jež je součástí tzv. G-proteinové signální dráhy. Vazba znemožní spojení Gtβγ s Gtα transducinu, což zabrání dalšímu přenosu signálu. Dysfunkce Pd by v důsledku dopadu intenzivního světla vedla k poškození sítnice. Dále se také zjistilo, že Pd ovlivňuje hypertensi a to tak, že snižuje krevní tlak u lidí a myší ve spánku. Ve tmou adaptované sítnici je funkce Pd regulována 14-3-3 proteinem. 14-3-3 je 28kDa protein nacházející se v mnohých tkáních eukaryot, především v mozku, a hrající roli v mnohých biochemických procesech, např. apoptose. Role 14-3-3 v sítnici oka spočívá ve vazbě fosforylovaného Pd, jeho udržení ve vnitřním segmentu tyčinek a zabránění tak jeho vazbě s Gtβγ, čímž se zajistí další možnost přenosu signálu k očnímu nervu. Pro vazbu je nutná fosforylace Pd na Ser54 a Ser73. Tvorba...
|
|
|
Vliv deplece cholesterolu na signální dráhu iniciovanou receptory spřaženými s G proteiny třídy Gq/G11
Ostašov, Pavel ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Teisinger, Jan (oponent) ; Hof, Martin (oponent)
Membránové domény jsou důležitou strukturou v plazmatické membráně. Koncentrují se v nich různé signální molekuly. Jejich hlavní strukturní složkou je cholesterol a jeho odstraněním dochází k jejich narušení. Předkládaná práce se zabývá vlivem, jaký má deplece cholesterolu na signalizaci iniciovanou thyreotropním hormonem (TRH), jehož signální kaskáda se pravděpodobně nachází v membránových doménách, ač on sám není jejich součástí. S pomocí látky -cyclodextrin jsme depletovali cholesterol z plazmatických membrán. Ukázali jsme, že deplece cholesterolu vede k uvolňování Gq/11 proteinů a kaveolinu 2 z membránových domén. Také jsme ukázali, že tato deplece vede ke snížení schopnosti TRH aktivovat trimerní G proteiny stejně jako indukovat výlev Ca2+ z intracelulárních zásob. V poslední části jsme prozkoumali efekt deplece cholesterolu na mobilitu TRH receptoru v plazmatické membráně a na jeho internalizaci indukovanou TRH. K tomuto účelu byla použita linie buněk HEK 293 stabilně exprimující fuzní protein TRH-R-eGFP. Studie s pomocí konfokálního mikroskopu ukázaly, že internalizace receptoru je výrazně potlačena. Detailní analýza návratu fluorescence TRH-R-eGFP do vybělených oblastí o různých velikostech ukázala, že deplece cholesterolu zvyšuje mobilitu receptoru. Jsme přesvědčeni, že návrat fluorescence probíhá...
|
|
| |
host ::
RSS.