|
|
Příprava delečních mutantů lidského cytochromu b5 pomocí genové syntézy
Kotlánová, Iveta ; Martínek, Václav (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
Cytochrom b5 je malý amfipatický protein. Jeho lidská forma se nachází ukotvena ve vnější membráně endoplazmatického retikula a mitochondrií, volně se nachází v červených krvinkách. Skládá se ze dvou domén: Větší hydrofilní doména váže hem, menší hydrofobní doména ukotvuje cytochrom b5 v mikrosomální membráně. Obě domény jsou spojeny linkerem, což je řetězec asi 15 aminokyselin, který dodává proteinu potřebnou flexibilitu. Jeho délka hraje významnou roli při přenášení elektronů na cytochrom P450. Pokud je linkerová doména příliš krátká, cytochrom b5 nedokáže přenášet elektrony na cytochrom P450 a neúčastní se tak reakcí MFO systému. Ostatní funkce jsou však zachovány. Cílem této práce bylo navrhnout a pomocí genové syntézy vytvořit 4 deleční mutanty cytochromu b5. Jejich linkerová doména obsahovala krátké i dlouhé delece, u kterých se předpokládá narušení interakce s cytochromem P450. Součástí práce byla heterologní exprese proteinů pomocí buněk Escherichia coli kmenů XL10-Gold a DH5α. Jako expresní vektory pro transformaci byly použity plasmidy pET-30a(+) a pET-22b. DNA byla z buněk izolována a sekvenací byla ověřena správnost genetického kódu. Klíčová slova: cytochrom b5, heterologní exprese, genová syntéza
|
|
|
Metabolismus karcinogenů a léčiv monooxygenasovým systémem
Moserová, Michaela ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Entlicher, Gustav (oponent) ; Čeřovská, Noemi (oponent)
Ellipticin, alkaloid z rostlin čeledi Apocynaceae, vykazuje významný protinádorový a anti-HIV účinek. Je pro-léčivem, jehož farmakologická účinnost a vedlejší genotoxické účinky závisí na metabolické aktivaci cytochromy P450 (CYP) a peroxidasami (Px). Z toho důvodu bylo cílem disertační práce poznání příspěvku jednotlivých CYP a Px k oxidaci ellipticinu v různých tkáních (játra, plíce a ledviny) laboratorního potkana, který byl vybrán jako vhodný model ilustrující osud ellipticinu v lidském organismu. Dále byly využity mikrosomální systémy myší s "deletovanou" reduktasou v játrech (HRNTM ) a myší kotrolní linie (WT) a purifikované enzymy CYP1A1 a 3A4. Sledován byl i vliv cytochromu b5 na produkci jednotlivých metabolitů (aktivačních a detoxikačních) ellipticinu a tvorba aduktů aktivovaného ellipticinu s DNA. Karcinogenní benzo[a]pyren (BaP) je po své aktivaci cytochromy P450 (CYPs) schopný kovalentní vazby na DNA. Sledovali jsme jeho schopnost tvorby aduktů s DNA a indukce enzymů CYP a NADPH:CYP reduktasy (RED) v myších játrech, hlavním orgánu tvorby aduktů BaP s DNA. CYP1A1 je označován za nejdůležitější enzym v metabolické aktivaci BaP. V práci jsme sledovali vliv jednotlivých složek systému monooxygenas se smíšenou funkcí (MFO systému) na metabolismus BaP. V disertační práce byly využity mikrosomální...
|
|
|
Přenos nabitých a nenabitých částic přes modelové biologické membrány
Parisová, Martina ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
Tato práce je zaměřena na přípravu modelových stabilizovaných fosfolipidových membrán utvářených na porézním polykarbonátovém nosiči. Pro jejich utváření v pórech hydrofilního polykarbonátového nosiče byl použit 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3- fosfocholin. Pro charakterizaci formování fosfolipidových vrstev, jejich změn a studium transportních procesů byla využita elektrochemická impedanční spektroskopie a voltametrie. Transport kademnatých a měďnatých iontů byl studován v přítomnosti ionoforu calcimycinu a při jeho absenci, který byl inkorporován do vytvořené fosfolipidové membrány. Protože jsou uvedené ionty často vázány v komplexech s různými látkami, jako jsou nízkomolekulární organické kyseliny (low molecular weight organic acids, LMWOAs), byla tato práce zaměřena také na přenos měďnatých a kademnatých iontů přes modelové fosfolipidové membrány v přítomnosti kyseliny jablečné, citronové a šťavelové při různém pH. Kromě použitého ionoforu byly provedeny pilotní experimenty přenosu měďnatých iontů za pomoci dvou peptidů, nisinu a transportanu 10. Utváření membrány a transportní procesy byly charakterizovány pomocí dvou navržených náhradních elektrických obvodů, které odpovídají situaci pokrytého a nepokrytého polykarbonátového nosiče. Klíčová slova: Fosfolipidy, Membrány, Ionofor, Peptid,...
|
|
|
Vývoj nové metody pro in vitro selekci DNA aptamerů
Bláhová, Kamila ; Míšek, Jiří (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
DNA či RNA, které vázat různé molekuly (léčiva, lipidy, cukry, proteiny atd.) oligonukleotidů pomocí metody SELEX Přes úspěšnost této metody, kce často vyžaduje více než deset kol afinitní selekce a taktéž optimalizaci podmínek selekce. Pro zvýšení účinnosti selekce aptamerů bylo vyvinuto několik metod, které využívají zvýšení počtu sekundárních struktur náhodných knihovnách oligonukleotidů. Tyto metody, založené na zvýšení možnosti jednovláknových oligonukleotidech, zvýšily efektivitu metody o testováno, jestli zvýšení pravděpodobnosti výskytu kvadruplexů, jako strukturních motivů náhodných sekvencích, povede ke zvýšení efektivity selekce aptamerů. Byly použity čtyři knihovny počtem guaninu (25 %, 35 %, 45 %, 55 %) v selekci byl zvolen streptavidin, vůči kterému již bylo dříve vyselektováno několik aptamerů, (G). Předběžné výsledky naznačují, že G nezvyšují efektivitu selekce přinejmenším u molekul, které nepreferují G Klíčová slova:
|
|
|
Příprava nádorového ligandu B7-H6 s coiled-coil kotvou a ověření jeho vazby na receptor NKp30
Krejčová, Kateřina ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
NK buňky jsou přirozené zabíječské buňky (z angl. natural killer cells) podílející se na protinádorové imunitě. Tyto buňky jsou schopny zabránit vzniku virové infekce či nádorového onemocnění, a to bez předešlé senzitizace antigenem. Mechanismus aktivace NK buněk je založen na principu snížené exprese MHC gp I molekul na povrchu nádorových buněk. Na povrchu NK buněk jsou přítomny receptory, které jsou schopny rozlišit jak aktivační, tak inhibiční signály, které rozhodují o tom, zda dojde k aktivaci NK buněk a zabití cílové buňky, či nikoliv. NKp30 je transmembránový receptor I. typu, který rozeznává stresem indukovaný buněčný ligand B7-H6. Interakce těchto proteinů je signálem pro imunitní systém k zahájení imunitní odpovědi. Tato práce se zaměřuje na přípravu buněčného ligandu B7-H6 s peptidovou coiled- coil kotvou v liniích lidských embryonálních ledvinných buněk HEK293S GnTI- a HEK293T. Byl úspěšně připraven protein s coiled-coil kotvou na C-konci proteinu, což bylo ověřeno hmotnostní spektrometrií. Rovněž byla pomocí sedimentační analýzy potvrzena interakce připraveného proteinu s receptorem NKp30. Klíčová slova: NK buňky, rekombinantní exprese, B7-H6, HEK293, coiled-coil
|
|
|
Enzymová fukosylace oligosacharidů
Horáčková, Karolína ; Bojarová, Pavla (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
Fukosylované oligosacharidy se přirozeně vyskytují v těle savců, tvoří například antigeny krevních skupin nebo oligosacharidy mateřského mléka. Oligosacharidy mateřského mléka působí jako inhibitory epiteliální buňky trávicího traktu kojenců, čímž zabraňují vzniku průjmových onemocnění Mezi nejhojněji zastoupené oligosacharidy mateřského mléka patří 2' Syntéza fukosylovaných oligosacharidů je výhodná z hlediska suplementace do umělé kojenecké výživy, čímž lze riziko průjmových onemocnění snížit. Syntéza oligosacharidů mateřského mléka přirozeně probíhá v Golgiho aparátu pomocí fukosyltransferas, avšak glykosyltransferasy jsou obecně velmi stereo selektivní a jako donory používají cukerné nukleotidy, které jsou nestabilní a finančně nákladné. V rámci této práce je demonstrována příprava fukosylgalaktosy a 2' fukosyllaktosy pomocí mutantní α patřící do glykosidhydrolas (rodina GH 29), která díky mutacím vykazuje vyšší transglykosylační aktivitu. Rekombinantní enzym byl exprimován v a byla charakterizována jeho enzymová aktivita, pH a teplotní optimum. Jako donor pro enzymovou syntézu byl využit α Preparativně byla provedena pouze příprava 2 ktosy, přítomnost 2' reakční směsi byla potvrzena měřením hmotnostních spekter. Klíčová slova enzymová syntéza; fukosidasa; fukosylace; mateřské mléko; sacharid
|
|
|
Příprava reportérové buněčné linie pro ověření biologické aktivity rekombinantních proteinů
Kozojedová, Petra ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
NK buňky patří mezi imunitní buňky zprostředkovávající nespecifickou imunitní odpověď organismu. Exprimují na svém povrchu řadu ligand-specifických aktivačních či inhibičních receptorů, mezi které patří přirozeně cytotoxický aktivační receptor NKp30, indukující po interakci s ligandem cytotoxickou odpověď. Receptor NKp30 má jednu ligand vazebnou imunoglobulinu podobnou extracelulární doménu s krátkou "stalk" doménou, která umožňuje oligomerizaci extracelulární domény receptoru NKp30, což vede k posílení interakce ligand- receptor a ovlivnění signalizace vedoucí k aktivaci buňky. Tato práce se zabývá přípravou konstruktů inspirovaných technologií chimerních antigenních receptorů nesoucích extracelulární doménu receptoru NKp30 se "stalk" doménou či pouze ligand vaznou doménu pro ověření biologické aktivity konstruktů po expresi na buněčné membráně. Byly připraveny dva vektory pro expresi konstruktů inspirovaných chimerními antigenními receptory s geny pro extracelulární doménu receptoru NKp30. Pro ověření biologické aktivity různých konstruktů byla plasmidová DNA kódující připravené konstrukty transientně transfekována do buněk Jurkat. Klíčová slova: NK buňky, NKp30, reportérová buněčná linie, rekombinantní protein, chimerní antigenní receptor
|
|
| |
|
| |
|
|
Exprese V-ATPázy v hypoxii u buněk neuroblastomu
Kittlerová, Kateřina ; Eckschlager, Tomáš (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
Nádorová onemocnění se v dnešní době řadí mezi nejčastější příčiny smrti na celém světě, proto se stále pracuje na nových protinádorových léčivech a terapeutických přístupech. U dětí a mladistvých jsou nádorová onemocnění druhou nejčastější příčinou smrti. Mezi jeden z často diagnostikovaných nádorů u dětí a mladistvých patří neuroblastom. Jedná se o maligní embryonální nádor periferního nervového systému. K léčbě nádorových onemocnění se s dalšími terapeutickými postupy jako je chirurgické odstranění a ozáření nádoru používá léčba cytostatiky - chemoterapie. Cisplatina je jedno z nejpoužívanějších cytostatik, její účinnost je ale ztěžována vznikem rezistence v průběhu léčby. Vakuolární ATPáza (V-ATPáza) acidifikuje některé buněčné organely včetně lysozomů, což může vést k lysozomální sekvestraci některých látek včetně cytostatik a tím tedy zabránění léčivu dostat se k terapeutickému cíli. Klíčovou roli v regulaci lysozomální aktivity hraje transkripční faktor EB (TFEB). Tato práce se zabývá expresí d podjednotky vakuolární ATPázy (ATP6V0D1) a TFEB u neuroblastomové buněčné linie senzitivní UFK-NB-4 a rezistentní vůči cisplatině UKF-NB-4CDDP v normoxii a hypoxii. Po vystavení neuroblastomových buněk rezistentních vůči cisplatině UKF-NB-4CDDP došlo ke zvýšení exprese genu ATP6V0D1 vůči normoxii. V...
|
host ::
RSS.