|
|
Aktivita cytochromů P450 1A1, 1A2 a 3A4 exprimovaných v eukaryotních a prokaryotních systémech
Indra, Radek ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Mizerovská, Jana (oponent)
Cytochromy P450 (CYP) tvoří superrodinu hemových proteinů, jenž je široce rozšířená v přírodě. Jsou důležité pro metabolismus širokého spektra substrátů a katalyzují řadu chemických reakcí. Hrají centrální roli v metabolismu chemoterapeutik (léčiv). Mají také schopnost aktivovat některé protinádorové činidla. Ellipticin, alkaloid nalezený v rostlinách čeledi Apocynaceae, je příkladem takového substrátu cytochromů P450. V práci byla testována efektivita lidských rekombinantních cytochromů P450 exprimovaných v eukaryotickém a prokaryotickém expresním systému, jmenovitě v SupersomechTM , což jsou mikrosomy izolované z hmyzích buněk transfekovaných baculovirem nesoucím cDNA lidských CYP1A1, 1A2 a 3A4 s NADPH:cytochrom P450 reduktasou nebo v Bactosomech, které jsou membránovou frakcí buněk E. coli transfekovaných cDNA stejných lidských cytochromů a NADPH:cytochrome P450 reduktasou, pro oxidaci jejich markerových substrátů a ellipticinu. Cytochrom b5, fakultativní složka systému oxidas se smíšenou funkcí, která metabolizuje xenobiotika, byl také exprimován v některých systémech. Výsledky získané v diplomové práci demonstrují, že lidské CYP1A1, 1A2 nebo 3A4 exprimované v prokaryotickém nebo eukaryotickém systému oxidují své markerové substráty (EROD pro CYP1A1/2, MROD pro CYP1A2 a 6β-hydroxylaci testosteronu pro...
|
|
| |
|
|
Mechanismus enzymové aktivace karcinogenů a léčiv systémem cytochromů P450
Indra, Radek ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Souček, Pavel (oponent) ; Koblihová, Jitka (oponent)
12 Abstrakt Environmentální polutant benzo[a]pyren (BaP) je prokazatelným lidským karcinogenem, který se po aktivaci cytochromy P450 (CYP) kovalentně váže na DNA. V rámci dizertační práce byl studován vliv jednotlivých složek systému monooxygenas se smíšenou funkcí (MFO), systému lokalizovanému v membráně endoplasmatického retikula, na metabolismus benzo[a]pyrenu a na tvorbu aduktů BaP s DNA. Zaměřili jsme se především na porovnání vlivu cyt b5 na tento metabolismus a potenciál cyt b5 sloužit jako donor elektronů v rámci reakčního cyklu cytochromu P450 1A1. Tento vliv byl studován jednak z pohledu tvorby metabolitů BaP, a jednak z pohledu tvorby jeho aduktů s DNA. Byl také studován vliv dvou expresních systémů pro cytochrom P450 1A1 (prokaryotický a eukaryotický), na jeho účinnost v metabolismu BaP. Vliv cyt b5 na účinnost monooxygenasového systému byl studován i s další cizorodou látkou, rostlinným alkaloidem ellipticinem, jenž vykazuje protinádorové účinky. Jeho protinádorový efekt, stejně jako vedlejší účinky, závisí na jeho metabolické aktivaci cytochromy P450. Významný z tohoto hlediska je zejména CYP3A4. Ten byl proto použit i v našich experimentech. Dále byla v práci studována vhodnost laboratorního potkana sloužit jako model metabolického osudu BaP v lidském organismu. Při studiu...
|
|
|
Chemoenzymová synthesa antivirálních profarmak
Tupec, Michal ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Indra, Radek (oponent)
Lipasy našly široké uplatnění při výrobě potravin a v některých odvětvích průmyslu, později i v syntetické organické chemii, kde za velmi mírných podmínek katalyzují hydrolytické a esterifikační reakce v rámci chemie chránicích skupin či za účelem rozlišení enantiomerů. V této práci byla komerčně dostupná lipasa z bakterie Pseudomonas fluorescens imobilizována pomocí sol gelového procesu do organokřemičitých materiálů s propylovým, oktylovým nebo fenylovým substituentem. Nejvyšší hydrolytická aktivita byla zjištěna u enzymu na oktylovém nosiči. Imobilizované enzymy se mezi sebou lišily v hydrolytické aktivitě stanovené na různě dlouhých 4-nitrofenylesterech. Další experimenty ukázaly na poměrně dobrou pH stabilitu enzymů při inkubacích (pH 3 až 11) a dále také dobrou teplotní stabilitu v isooktanu (teploty až 100 řC). Většina organických rozpouštědel nemá výrazný vliv na aktivitu lipasy. Za použití modelové látky ze skupiny acyklických analogů nukleosidů - 9 (2',3' dihydroxypropyl)adeninu (DHPA) - byla provedena řada biokatalytických pokusů. Bylo např. zjištěno, že jako donory acylu jsou nejvhodnější vinylestery, že lipasa vykazuje preferenci k vinylesterům s delším acylem, že esterifikace DHPA nejrychleji probíhá v nepolárních rozpouštědlech a že je možná i v rozpouštědlech, v nichž je tato látka zcela...
|
|
|
Vliv pH na oxidaci vandetanibu
Fedák, Michal ; Indra, Radek (vedoucí práce) ; Otáhalová, Barbora (oponent)
Vandetanib je protinádorové léčivo využívající se zejména pro cílenou léčbu medulárního karcinomu štítné žlázy. Působí jako inhibitor tyrosinkinas a vyznačuje se selektivitou vůči receptorům vaskulárního endoteliálního růstového faktoru 2 (VEGFR-2), epidermálního růstového faktoru (EGFR) a inhibuje také tyrosinkinasovou aktivitu přesmyku během transfekce (RET). V organizmu lidí a také experimentálních zvířat je vandetanib metabolizován pomocí cytochromů P450 (CYP) a flavinmonooxygenas (FMO). Pomocí CYP je vandetanib oxidován za vzniku N-desmethylvandetanibu. Působením FMO se z vandetanibu tvoří vandetanib N-oxid. V této bakalářské práci byl studován vliv pH na oxidaci vandetanibu pomocí CYP a FMO obsažených v potkaních jaterních mikrosomech indukovaných různými činidly. Získaná data ukazují, že ve většině sérií jsou optimální hodnoty pH oxidace vandetanibu jak pomocí CYP, tak FMO dosti podobné. Největší množství N-desmethylvandetanibu bylo pozorováno hlavně při pH 8,5. Vandetanib N-oxid byl v největší míře tvořen také ve většině sérií při stejné hodnotě pH. Výsledky naznačují, že N-desmethylvandetanib je tvořen v největší míře při hodnotách pH, které nespadají do intervalu pH pro optimální aktivitu CYP. Vysvětlení pro toto zjištění poskytuje zřejmě fakt, že zastoupení vandetanibu v jeho neutrální...
|
|
|
Metabolismus vandetanibu cytochromy P450 exprimovanými v prokaryotním systému
Rodová, Marie ; Indra, Radek (vedoucí práce) ; Takácsová, Paulína (oponent)
Při léčbě nádorových onemocnění, nesoucích konkrétní molekulárně genetické nebo morfologické znaky, se v poslední době začíná uplatňovat biologicky cílená léčba neboli cílená molekulární terapie. Vandetanib je perorálně užívané protinádorové léčivo patřící do skupiny tyrosinkinasových inhibitorů. Tyto inhibitory blokují receptory signálních drah, a tak inhibují růst, zvyšují buněčnou smrt a omezují šíření rakoviny. V dubnu 2011 byl vandetanib schválen americkým úřadem FDA pro léčbu progresivní či symptomatické medulární rakoviny štítné žlázy. Využívá se u lidí s metastázovanou nebo lokálně pokročilou rakovinou, kterou nelze operovat. V předkládané bakalářské práci byl studován metabolismus vandetanibu. Práce rozšiřuje poznatky o kinetice oxidace vandetanibu na N-desmethylvandetanib lidskými rekombinantními cytochromy P450 3A4 exprimovanými v membráně E. coli (Bactosomy). Studován byl vliv přítomnosti cytochromu b5 a vliv hladiny aktivity NADPH:cytochrom P450 reduktasy na aktivitu cytochromů P450 3A4. Za použití Bactosomů byl identifikován demethylovaný metabolit vandetanibu N-desmethylvandetanib, který byl separován vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC). Studium enzymové kinetiky naznačuje, že na oxidaci vandetanibu má vliv jak hladina aktivity NADPH:CYP reduktasy, tak i přítomnost cyt...
|
|
|
Biokompatibilní polymerní nanomateriály s dexamethasonem v protizánětlivé terapii
Starenko, Daniil ; Etrych, Tomáš (vedoucí práce) ; Indra, Radek (oponent)
Chronická zánětlivá onemocnění jsou velmi rozšířená a ovlivňují život mnoha lidí po celém světě. Jejich dlouhodobá přítomnost v organismu může vést k rozvoji jiných nemocí, jako je diabetes, ateroskleróza a onkologická onemocnění. Současná terapie zpravidla nevede k úplnému uzdravení pacientů, ale je zaměřena na potlačení imunity s cílem zmírnit symptomy onemocnění. Nevýhodou této imunosuprese je mnoho nežádoucích vedlejších účinků v důsledku dlouhodobého a neselektivního působení léčiv. Jedním z aktivně zkoumaných směrů pro vylepšení efektivity léčby zánětlivých onemocnění je použití polymerních systému pro dopravu léčiv, které umožňují delší cirkulaci léčiv, jejich lepší distribuci, cílení a řízené uvolňování. Dexamethason je jedním z nejčastěji používaných glukokortikoidů při léčbě zánětlivých onemocnění, jehož vlastnosti mohou být použitím polymerních dopravních systémů zlepšeny. Kromě toho v poslední době nachází širší uplatnění v léčbě zánětů tzv. biologická léčba, při které se využívají protilátky schopné specificky rozeznávat a vázat se na antigen. Jednou z nich je chimérická monoklonální protilátka infliximab, inhibitor prozánětlivého tumor-nekrotizujícího faktoru α (TNF-α). Představována bakalářská práce se zabývá syntézou a charakterizaci polymerního konjugátu na bázi...
|
|
|
Příprava a metabolismus nanotransportérových forem inhibitorů tyrosinkinas
Urbanová, Tereza ; Indra, Radek (vedoucí práce) ; Bělonožníková, Kateřina (oponent)
Nádorová onemocnění jsou v současné době druhou nevýznamnější civilizační chorobou, není tedy divu, že v posledních desetiletích je jejich výzkum prioritou řady laboratoří. Problémem klasické léčby onkologických chorob, jejíž původ se datuje do počátku 40. let minulého století, je její nespecifičnost k nádorovým buňkám a s tím spojena celá řada vedlejších účinků. V posledních letech se objevil nový přístup k léčbě této závažné choroby, využívající nejrůznější nanotransportéry (liposomy, proteiny, ale i anorganické uhlíkové nanotrubice), které mohou cytostatika enkapsulovat a cíleně uvolnit až v okolí nádoru, to by mělo vést k minimalizaci vedlejších účinků. V této diplomové práci byla studována enkapsulace tří cytostatik (lenvatinibu, adavosertibu a sunitinibu) do apoferritinu. Dále v této diplomové práci byl studován vliv kavity apoferritinu na biotransformaci enkapsulovaného sunitinibu; biotransformace volného i vázaného sunitinibu pomocí biotransformačních enzymů vázaných v liposomech a v neposlední řadě také kinetika uvolňování sunitinibu z apoferritinové centrální dutiny. Bylo zjištěno, že lenvatinib není vhodným cytostatikem pro enkapsulaci do centrální dutiny apoferritinu kvůli své nízké rozpustnosti a zápornému náboji při bazickém pH. Adavosertib a sunitinib se jeví jako vhodnější alternativy pro...
|
|
|
Přeměna cabozantinibu enzymy první fáze biotransformace
Jurečka, Tomáš ; Indra, Radek (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
Cabozantinib je protinádorové léčivo, které inhibuje tyrosinkinasy zprostředkovávající signalizační dráhy důležité pro růst a vývoj nádorů. Je používán pro léčbu medulárního karcinomu štítné žlázy, hepatocelulárního karcinomu a karcinomu ledvin. Hlavními enzymy první fáze biotransformace, kterými je katalyzována přeměna cabozantinibu, jsou cytochromy P450. V diplomové práci byl studován metabolismus cabozantinibu a cytochromy P450 podílející se na tomto metabolismu. V práci byly pro studium metabolismu cabozantinibu používány jaterní mikrosomy potkana, myši a králíka. Rovněž byl sledován vliv jednotlivých izoforem cytochromů P450 na metabolismus cabozantinibu za použití potkaních mikrosomů. Studována byla také časová závislost přeměny cabozantinibu jaterními mikrosomy potkana. Zahrnuto bylo také studium enzymové kinetiky přeměny cabozantinibu jaterními mikrosomy potkana a studium vlivu inhibitorů cytochromů P450 na tento metabolismus. Metabolity byly analyzovány pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) a hmotnostní spektrometrie. Tvorba metabolitů cabozantinibu rostla s časem inkubace až do 30. minuty, u některých metabolitů až do 40. minuty. Během experimentů bylo detekováno až pět metabolitů cabozantinibu (M1, desmethylcabozantinib, M3, monohydroxycabozantinib a N-oxid cabozantinibu)....
|
|
|
Význam V-ATPasy pro rezistenci nádorových buněk
Suchánková, Kristýna ; Eckschlager, Tomáš (vedoucí práce) ; Indra, Radek (oponent)
Chemorezistence je jednou z hlavních příčin selhání léčby chemoterapie nádorů. Vakuolární ATPasa (V-ATPasa) je ATP-dependentní protonová pumpa podílející se na regulaci pH buněk, buněčných organel i intracelulárního prostoru. V souvislosti s metabolismem nádorových buněk (metabolismus glukosy, hypoxie, nedostatečné prokrvení nádorové tkáně) dochází k výrazné acidifikaci extracelulárního prostoru a intracelulárních kompartmentů. Bazická cytostatika přestupují na základě pH gradientu do kyselých organel, kde jsou následně protonována a akumulována. Tento mechanismus se nazývá lysosomální sekvestrace a je jedním z mechanismů rezistence nádorových buněk k podávaným léčivům, která se v důsledku vychytávání nedostanou do míst svého účinku. Zvýšená exprese V-ATPas byla popsána v souvislosti s chemorezistencí a progresí nádorů. Tato práce je zaměřena na sledování membránové podjednotky V0d z komplexu V-ATPasy a změn rezistence vůči ellipticinu způsobené umlčením genu této podjednotky v lidských neuroblastomových liniích UKF-NB-4 (senzitivní) a UKF-NB-4ELLI (rezistentní k ellipticinu). Exprese V0d byla nejprve zkoumána na úrovni mRNA pomocí kvantitativní polymerasové řetězové reakce v reálném čase (RT-PCR). K umlčení vybraných genů podjednotek V-ATPasy byla využita transfekce buněk molekulami siRNA (z angl....
|
host ::
RSS.