|
|
Directed evolution of enzymes on microfluidic chip
Kohúteková, Táňa ; Chmelíková, Larisa (oponent) ; Prokop,, Zbyněk (vedoucí práce)
This thesis focuses on the directed evolution of enzymes using Fluorescence–Activated Droplet Sorting (FADS) on a microfluidic chip. A new FADS system was constructed, validated for high-throughput optical detection of microfluidic droplets, and coupled with real-time dielectrophoretic sorting. The system was benchmarked using two different populations (DhaA31, ancHLD-RLuc) of Haloalkane dehalogenases (HLD) expressed in Escherichia coli cells and one population of empty pIDR9 vector in a ratio of 5:45:50, mimicking the protein library. The collected and analyzed sorting data show that the droplet intensities were recorded in the same proportion as the theoretical ratio. The library of HLD mutants with insertions and deletions was then sorted using the system to obtain 1 % of the variants with the highest activity and the results are reported. The FADS data analyzing system was programmed in LabVIEW bundled with Python, with functions for initial analysis, prediction of threshold voltage, validation and graphical interpretation of data, and final reporting of processes.
|
|
|
Engineering and selection of protein binders recognising medically important cytokines
Huličiak, Maroš
in Czech Proteinovému inženýrství se dostává čím dál tím více pozornosti jakožto užitečnému nástroji v oblasti biotechnologií a moderní medicíny. Malé, uměle vytvořené molekuly odvozené ze stabilních proteinů, tzv. skafoldů, jsou potenciální náhradou široce používaných protilátek. V této práci představuji využití dvou takovýchto skafoldů navržených v naší laboratoři pro vývoj stabilních vazebných proteinů s vysokou vazebnou afinitou i specifitou. Tato práce pojednává konkrétně o vývoji dvou vazebných molekul interagujících s lékařsky důležitými lidskými cytokiny a jejich buněčnými receptory - jmenovitě s interleukinem-10, receptorem interleukinu- 28 a alfa receptorem interleukinu-9. Rekombinantní cytokiny i oba receptory byly ve vysoké kvalitě a s vysokými výtěžky produkovány v eukaryotických buňkách a sloužily jako molekulární cíle pro selekci pomocí displejových metod řízené evoluce. Prokázali jsme, že aplikace ribozomálního a kvasinkového displeje, nebo jejich nekonvenční kombinace vede k úspěšnému generování vysoce afinitních a specifických vazebných molekul založených na nově navržených proteinových skafoldech nazvaných 57aBi a 57bBi.
|
|
|
Engineering and selection of protein binders recognising medically important cytokines
Huličiak, Maroš ; Schneider, Bohdan (vedoucí práce) ; Pichová, Iva (oponent) ; Kukačka, Zdeněk (oponent)
in Czech Proteinovému inženýrství se dostává čím dál tím více pozornosti jakožto užitečnému nástroji v oblasti biotechnologií a moderní medicíny. Malé, uměle vytvořené molekuly odvozené ze stabilních proteinů, tzv. skafoldů, jsou potenciální náhradou široce používaných protilátek. V této práci představuji využití dvou takovýchto skafoldů navržených v naší laboratoři pro vývoj stabilních vazebných proteinů s vysokou vazebnou afinitou i specifitou. Tato práce pojednává konkrétně o vývoji dvou vazebných molekul interagujících s lékařsky důležitými lidskými cytokiny a jejich buněčnými receptory - jmenovitě s interleukinem-10, receptorem interleukinu- 28 a alfa receptorem interleukinu-9. Rekombinantní cytokiny i oba receptory byly ve vysoké kvalitě a s vysokými výtěžky produkovány v eukaryotických buňkách a sloužily jako molekulární cíle pro selekci pomocí displejových metod řízené evoluce. Prokázali jsme, že aplikace ribozomálního a kvasinkového displeje, nebo jejich nekonvenční kombinace vede k úspěšnému generování vysoce afinitních a specifických vazebných molekul založených na nově navržených proteinových skafoldech nazvaných 57aBi a 57bBi.
|
|
|
Modulation of interactions of cytokines and their receptors
Kolářová, Lucie ; Schneider, Bohdan (vedoucí práce) ; Rozbeský, Daniel (oponent) ; Osička, Radim (oponent)
(In Czech) Protein-proteinové interakce, stejně jako interakce s dalšími molekulami například DNA a RNA, hrají důležitou roli v široké škále biologických aktivit a procesů v živých buňkách. Pochopení proteinových interakcí, nové přístupy a nástroje pro modulaci těchto interakcí jsou důležité pro medicínskou a biotechnologickou oblast výzkumu a vývoje. Jako modelový systém pro studium biologických interakcí a modulaci biologických funkcí jsme využili interleukiny z rodiny 10. Podmínkou studia biologických procesů a pochopení biomolekulárních interakcí je příprava rekombinantních proteinů, které jsou stabilní v širokém spektru podmínek. Exprese rekombinantních proteinů v dostatečném množství a kvalitě je ale často náročným úkolem. Naším cílem bylo proto vytvořit nové přístupy k produkci složitých proteinů. V této práci popisujeme modifikaci interleukinu-24 (IL-24), člena skupiny IL-10 rodiny pomocí níž jsme dosáhli zvýšení exprese a stability IL-24. Práce ukazuje, že aplikace proteinového inženýrství je vhodným nástrojem pro studium složitých proteinů. V druhé části této práce jsme se zaměřili na nové postupy v přípravě malých vazebných proteinů (skafoldů). Malé vazebné proteiny se staly ve vývoji proteinových léčiv slibnou alternativou k široce využívaným protilátkám. Nové vazebné proteiny se...
|
|
|
Usměrněná evoluce myšího polyomaviru
Váňová, Jana ; Španielová, Hana (vedoucí práce) ; Mašek, Tomáš (oponent)
Metoda usměrněné evoluce je novým přístupem pro přípravu proteinů s novými či pozměněnými vlastnostmi. Principem usměrněné evoluce je náhodná mutageneze kódující sekvence pro protein našeho zájmu následovaná selekcí vytvořených mutant na požadovanou vlastnost. Cílem této pilotní studie bylo prozkoumat možnost využití usměrněné evoluce pro změnu původního tropismu myšího polyomaviru a jeho přesměrování na buňky modelové linie nádoru prostaty. Pro přípravu náhodně mutovaného genu kódujícího hlavní kapsidový protein myšího polyomaviru, jenž je zodpovědný za interakci viru s buněčným receptorem pro vstup viru do buňky, byly využity metody "error-prone PCR" a "DNA-shuffling". Produkce virů nesoucích mutovaný hlavní kapsidový protein byla zajištěna místně-specifickou rekombinací Cre/loxP. Práce se zabývala i návrhem a charakterizací systému selekce virových mutant. Bylo zjištěno, že prostatické nádorové linie se významně liší ve schopnosti vázat a internalizovat částice odvozené od myšího polyomaviru. Tohoto poznatku může být v budoucnu využito pro přípravu viru podobných částic určených pro diagnostiku nádoru prostaty. Práce prokázala, že metodu usměrněné evoluce lze použít pro přípravu mutantních polyomavirů a identifikovala několik problematických částí postupu.
|
|
|
Směrování virových částic pro cílenou dopravu látek do buněk
Váňová, Jana ; Španielová, Hana (vedoucí práce) ; Kuthan, Martin (oponent)
Virové částice představují díky své struktuře a schopnosti vstupovat do buněk, kde uvolňují svůj obsah, atraktivní nástroj pro dopravu látek do buněk. Pro terapeutické využití virů je třeba zajistit specifický a vysoce účinný vstup do cílových buněk. K tomuto účelu byly vyvinuty různé techniky směrování virů na požadované receptory. Tato práce nabízí přehled metod používaných při přesměrování virů se záměrem zhodnotit dosavadní úspěšnost přesměrování z hlediska specificity a účinnosti vstupu vytvořených virových částic do buněk. Na základě publikovaných dat a s ohledem na mechanismy virové infekce ukazuje, že je obtížné zamezit nespecifickému vstupu virových částic do buňky a dosažení absolutní specificity je zřejmě nemožné. I přes tato drobná omezení jsou virové nanočástice převratným terapeutickým nástrojem pro dopravu látek do buněk a je třeba jejich potenciálu využít.
|
host ::
RSS.