|
|
Reactive modifications of RNA for bioconjugations with proteins and new enzymatic methods for the synthesis of base-modified RNA
Brunderová, Mária ; Hocek, Michal (vedoucí práce) ; Míšek, Jiří (oponent) ; Vaňáčová, Štěpánka (oponent)
Tato disertační práce je zaměřena na enzymovou syntézu na bázi modifikovaných RNA s různými funkčními skupinami, včetně reaktivních pro síťování proteinů, hydrofobních a fluorescenčních skupin nebo afinitních značek. Konstrukce oligonukleotidů modifikovaných na bázi je zabezpečena buď konvenční in vitro transkripcí s T7 RNA polymerázou, nebo inovativním přístupem využívajícím upravené mutantní DNA polymerázy a reakci prodlužování primerů (PEX). V první části práce byl nasyntetizován nový ribonukleosid trifosfátový stavební blok s reaktivní chloracetamidovou funkční skupinou pomocí Sonogashirovy kaplingové reakce ve vodní fázi katalyzované Pd, přímo aplikované na jodovaný nukleotid. Chloracetamidem modifikovaný trifosfát byl poté testován jako vhodný substrát pro in vitro transkripci s T7 RNA polymerázou s cílem zkonstruovat RNA sondy s jednou nebo více reaktivními skupinami. Selektivita chloracetamidem modifikovaných RNA pro thiol, nebo cystein a histidin obsahující (bio)molekuly byla ukázána modelovými biokonjugačními reakcemi a experimenty pro síťování se třemi RNA-vazebnými proteiny s různými strukturami a funkcemi. Účinná tvorba kovalentních RNA-protein aduktů byla potvrzena western blotem, gelovou elektroforézou a hmotnostní analýzou, které byly prováděny za denaturačních podmínek....
|
|
|
Modified nucleotides and DNA for electrochemical labelling and defined display of small molecules
Krömer, Matouš ; Hocek, Michal (vedoucí práce) ; Křen, Vladimír (oponent) ; Vrábel, Milan (oponent)
Souhrn Tato práce je zaměřena na enzymatickou syntézu sond pro elektrochemické značení, biokonjugace a ve své závěrečné kapitole, postavené na poznatcích získaných v předchozích částech, popisuje metodu pro přípravu vysoce funkcionalizované DNA modifikované na bázích, využitelnou pro kontrolovanou multivalentní prezentaci glykosidů. V první částí byla nalezena metoda pro přípravu nukleotidů nesoucích diolové skupiny. Sonogashirova reakce umožnila přístup k diolům připojeným přes alkynovou spojku, následná katalytická hydrogenace, poprvé popsána v literatuře, poté poskytla cestu k diolům připojeným přes flexibilní sp3 hybridizovanou spojku, a to bez použití chránících skupin. Štěpení diolů připojených k nukleotidům přes sp3 spojku, nikoliv však přes alkynovou spojku, vedlo ke vzniku nukleotidu modifikovaného alifatickým aldehydem. Všechny nukleotidy byly dobrými substráty pro KOD XL DNA polymerázu, jak v reakci extenze primeru, tak v polymerázové řetězové reakci, vyjma aldehydem modifikovaného dUTP, který byl akceptován v PEX, ale produkty PCR reakce vznikaly pouze ve směsích s přirozeným dTTP. Toto omezení bylo překonáno štěpením diolů až po inkorporaci do DNA, čímž také vznikla DNA modifikovaná aldehydovými skupinami. Všechny reaktivní sondy byly použiti pro biokonjugace s fluorescenčním hydrazeinem, pro...
|
host ::
RSS.