|
|
CRISPR/Cas genome editing in human disease models and the translation into therapies
Faltínová, Pavlína ; Krupková, Michaela (vedoucí práce) ; Šedová, Lucie (oponent)
Vzácná onemocnění, jak už jejich název napovídá, individuálně postihují jen malý počet lidí na celém světě. Vzhledem k jejich nízké prevalenci je nalezení vhodné terapie velmi obtížné. Neuspokojivé pochopení molekulárních příčin a mechanismů, které je provázejí, a nemožnost provádět klinické studie v obvyklém rozsahu v důsledku nízkého výskytu vzácných onemocnění patří k hlavním problémům, které zbržďují vývoj vhodné léčby. Tvorba myších modelů je slibnou cestou k vyřešení těchto obtíží, neboť myši mají řadu vlastností nezbytných pro modelování lidských onemocnění. CRISPR/Cas9 umožňuje vědcům provádět přesné změny v genomu pomocí nukleázy Cas9, která vytváří dvouřetězcové zlomy v DNA poté, co ji speciálně navržená guide RNA přivede k místu zájmu. Pokud je sekvence zvoleného místa známá, lze možné úpravy zavést téměř kamkoliv do genomu a jejich repertoár je navíc prakticky nekonečný. Využití CRISPR/Cas9 technologie se ukázalo být ideální pro tvorbu myších modelů vzácných onemocnění, neboť většina těchto poruch je způsobena genetickými mutacemi, které dokáže tato metoda plně napodobit. Tato práce se zaměřuje na strategie využívané při tvorbě myších modelů pomocí systému CRISPR/Cas9 a shrnuje jejich podrobné mechanismy. Klíčová slova: vzácná onemocnění, myší model, CRISPR/Cas9, knock-out,...
|
|
|
Vývoj buněk neurální lišty u zebřičky Danio rerio
Psutková, Viktorie ; Machoň, Ondřej (vedoucí práce) ; Fabian, Peter (oponent) ; Svoboda, Ondřej (oponent)
Neurální lišta je populace volně migrujících buněk, kterou najdeme pouze u obratlovců. Buňky neurální lišty migrují do hlavové, srdeční a trupové oblasti těla, kde se přeměňují v různé buněčné typy. V případě hlavové neurální lišty se buňky diferencují mimo jiné i do chondrocytů a tenocytů. Právě tato unikátní vlastnost hlavové neurální lišty přinesla obratlovců evoluční novinku, lebku. V této práci se zaměřuje na vývoj hlavové neurální lišty a derivátů z ní odvozených u dánia pruhovaného (Danio rerio). Proudy hlavové neurální lišty se během migrace řídí antero-posteriorním nastavením těla daným hox geny. Samotný vývoj neurální lišty je řízen navzájem se ovlivňující sítí genů. Zde jsme se zaměřili na geny meis v rámci kraniofaciálního vývoje dánia. Ke studiu této problematiky jsme použili linie knock out (KO) mutantů pro každý paralog meis genu. Ze čtyř mutantů, meis1a, meis1b, meis2a, meis2b, pouze u meis1b KO a double meis1a1b KO mutantů dochází k deformaci hlavových chrupavek, derivátů neurální lišty. Tyto změny jsme identifikovali už během růstu chrupavek, avšak nikoliv na začátku vývoje během migrace neurální lišty do žaberních oblouků a následné kondenzace chondrocytů. Utváření obličejové části lebky tzv. viscerokrania je výsledkem provázanosti vývoje několika tkání. Jednou z těchto tkání...
|
|
|
Knockout isoforem metalothioneinu pomocí metody CRISPR-Cas9 u adherentních tkáňových kultur
Duda, Jakub
Modifikace genomů byly ještě donedávna velmi složité a v některých případech i nemožné, s objevením a popsáním systému CRISPR u prokaryot však přišla řada průlomů, díky nimž byl systém CRISPR modifikován pro užití jakožto nástroj pro editaci genomu u eukaryotických organismů. Genetické modifikace by teoreticky mohly být klíčové při novodobé terapii rakoviny, a tato práce se zaměřuje na proteiny Metalothioneiny, které se v organismech běžně vyskytují a jsou organismu prospěšné (například jakožto inhibitory oxidativního stresu a nebo antioxidanty navazující na sebe těžké kovy), ale podle isoformy a také typu tkáně mohou buďto svou přítomností, nebo absencí zapříčinit rozvoj rakoviny a růst nádorů. Cílem této práce bylo zaměření se na možnost zavedení knock-outu pomocí metody CRISPR/Cas9 u všech isoforem metalothioneinů najednou, a tím ovlivnění jednoho z velmi významných faktorů karcinogeneze. Výsledkem této práce je dosažení knock-outu u isoformy MT3.
|
|
|
Neuronální buněčné kultury in vitro
Kohoutová, Šárka ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Neuronální buněčné kultury jsou in vitro kultury disociovaných neuronů, které se již v minulém století staly neodmyslitelnou součástí mnoha neurobiologických experimentů. Kultivované neurony umožňují nejen odpovědět na otázky ohledně jejich fyziologie v komplexních in vivo podmínkách, ale rovněž mohou sloužit jako modely neurodegenerativních onemocnění. Neuronální buňky lze izolovat buďto přímo z nervové tkáně živočichů v prenatálním či dospělém stádiu vývoje, nebo jsou získávány skrze cílené manipulace kmenových buněk a sekundárních buněčných linií, které vedou k jejich neuronální diferenciaci. Primární neurony jsou považovány za zlatý standard neurobiologického výzkumu nejen z důvodu, že jejich kultivace má dlouholetou tradici, ale také proto, že odráží typické vlastnosti neuronů v in vivo podmínkách. S primárními neurony je spojena řada nevýhod, včetně skutečnosti, že plně diferencované neurony neproliferují a jsou poměrně náročné na kultivační podmínky. Z tohoto důvodu jejich roli často nahrazují mitoticky aktivní sekundární buněčné linie či kmenové buňky. Tato bakalářská práce shrnuje poznatky o buněčných kulturách využívaných ke studiu funkcí nervových buněk a poukazuje na výhody a nevýhody jejich využití. Klíčová slova Primární neurony, primární hipokampální neurony, neurální kmenové buňky,...
|
|
|
Insertion of CRISPR system to carrot to enable genome editing
Chaloupský, Pavel
Main goal of this study was to develop carrot plants and callus lines with stable expression of Cas9 and Cpf1 genes. To achieve the thesis objective, transformation of Escherichia coli and Agrobacterium tumefaciens strains with different codon-optimized CRISPR constructs was carried out. Agrobacterium-mediated carrot callus transformation with CRISPR constructs, induction of somatic embryogenesis, and molecular confirmation of transgenic events in carrot were also part of the experiment executed within this thesis. By use of PCR-based genotyping, transgene was confirmed in 346 calli. Relative expression of Cas9 and Cpf1 in 15 selected lines was measured.
|
|
|
Boj za lidskou důstojnost v éře moderní eugeniky. Molekulární nástroj editace genomu CRISPR/CAS9 a jeho užití v lidské genové terapii z pohledu teologické etiky
Auxt, Miroslav ; Štica, Petr (vedoucí práce) ; Fošum, Jan (oponent)
Nedávný průlomový objev molekulárního nástroje editace genomu CRISPR/CAS9 představuje v oblasti molekulární biologie, biomedicíny a dalších přidružených oborů naprostou revoluci. Jedná se o vysoce efektivní biomolekulární nástroj, odvozený od bakteriálního imunitního systému, kterým je možné zavádět přesné změny v genomech všech organismů. Diplomová práce se omezuje na etické hodnocení použití CRISPR/CAS9 výlučně v lidské genové terapii. Díky efektivitě, jednoduchosti, přesnosti a nízkým finančním nákladům má již nyní editační nástroj CRISPR/CAS9, při dodrženi etických parametrů, širokospektrální využití v terapeutických postupech na somatických neboli tělních buňkách při léčení lidských geneticky podmíněných onemocnění bez zavedení změny do budoucího potomstva daného jedince. Kromě velkého terapeutického potenciálu, aplikace CRISPR/CAS9 vyvolává mnohé etické otázky spojené s možnostmi jejího dalšího využití, příp. zneužití. Mezi eticky problematické genetické postupy se řadí: lidská dědičná editace genomu, tedy cílené pozměňování genomu pohlavních buněk, progenitorových buněk a buněk raných embryonálních vývojových stadií s terapeutickým cílem eliminace geneticky podmíněného onemocnění spojeného se zavedením této změny do budoucího potomstva daného jedince. Dále jsou to kontroverzní neterapeutické...
|
|
|
Analýza genové rodiny Gretchen Hagen 3 v buněčných kulturách BY-2 tabáku
Helusová, Lenka ; Müller, Karel (vedoucí práce) ; Pěnčík, Aleš (oponent)
Konjugace auxinu patří k zásadním metabolickým procesům regulujících aktivitu auxinu v rostlinných buňkách. Mezi důležité enzymy konjugující auxin s aminokyselinami patří skupina amidoacyl syntetáz z rodiny Gretchen Hagen 3 (GH3). Díky existenci citlivějších metod detekce auxinových metabolitů i aktuálnosti studia účinku abiotických stresů je v poslední době výzkum GH3 enzymů na vzestupu. Lépe známy jsou tyto enzymy u huseníčku rolního (Arabidopsis thaliana), sóji (Glycine max) a rýže (Oryza sativa). Tyto modely však neumožňují detailnější biochemické studium jejich aktivit. Proto bylo cílem této práce sledování metabolismu auxinu v zavedeném modelu tabákových buněčných linií BY-2 (Nicotiana tabacum). Geny NtGH3.1 a NtGH3.6, u kterých byla v tomto systému prokázána variabilní regulace jejich exprese auxinem, byly cíleně mutovány metodou CRISPR/Cas9. Mutace v odvozených liniích byly ověřeny sekvenací a u těchto linií byl analyzován pomocí LC/MS metabolický profil auxinu. Toto metabolické profilování poukázalo na souvislost formy NtGH3.6d se specifickou produkcí metabolitu oxIAA-Gln (N-(2-oxindol-3-acetyl)-glutamin). Studium případné zástupnosti jednotlivých forem genů GH3 v mutovaných liniích metodou RT-qPCR ukázalo, že zástupnost je nejspíš poměrně malá. Jednotlivé geny byly také označeny pomocí...
|
|
|
CRISPR/Cas9 editing of leukemic B-cells: searching for microRNA-155 targets involved in the process of leukemogenesis
Sypecká, Markéta ; Savvulidi Vargová, Karina (vedoucí práce) ; Zadražil, Zdeněk (oponent)
Editace leukemických B-buněk pomocí CRISPR/Cas9: hledání cílů miR-155 účastnících se procesu leukemogeneze Úvod: Chronická lymfocytární leukémie (chronická lymfoidní leukémie, CLL) je monoklonální porucha charakterizovaná postupnou akumulací funkčně nekompetentních B- lymfocytů. CLL je nejběžnější formou leukémie u dospělých v západních zemích. Průběh onemocnění se může lišit: někteří pacienti umírají rychle, během 2-3 let od diagnózy, převážně kvůli komplikacím z CLL, ale většina pacientů žije 5-10 let. S progresi nemoci stoupá exprese miR-155, která je označována jako oncomiR. MikroRNA (miRNA) představují negativní regulátory genové exprese. MiR-155 ovlivňuje geny, které se účastní leukemogeneze a buněčného cyklu. A je známo, že miR-155 (podobně jako i jiné miRNA) potlačuje své cíle. Předpokládali jsme, že úpravou genů v CLL bunkách odblokujeme cíle miR-155 a zjistíme korelaci mezi těmito cíli (známými a neznámými) s leukemogenezí CLL. Metody: Metodu, kterou jsme použili pro editaci genů, je CRISPR/Cas9, která umožňuje odstranit sekvenci maturované miR-155 v genomu leukemických B-buněk. K přenosu plasmidu CRISPR/Cas9 byla využita metoda nukleofekce. K identifikaci buněčných klonů s úspěšnou transfekcí plasmidu CRISPR/Cas9 došlo pomocí FACS a míra exprese jednotlivých genů byla měřena pomocí...
|
|
|
CRISPR/Cas9 editing of leukemic B-cells: searching for microRNA-155 targets involved in the process of leukemogenesis
Sypecká, Markéta ; Savvulidi Vargová, Karina (vedoucí práce) ; Zadražil, Zdeněk (oponent)
Editace leukemických B-buněk pomocí CRISPR/Cas9: hledání cílů miR-155 účastnících se procesu leukemogeneze Úvod: Chronická lymfocytární leukémie (chronická lymfoidní leukémie, CLL) je monoklonální porucha charakterizovaná postupnou akumulací funkčně nekompetentních B- lymfocytů. CLL je nejběžnější formou leukémie u dospělých v západních zemích. Průběh onemocnění se může lišit: někteří pacienti umírají rychle, během 2-3 let od diagnózy, převážně kvůli komplikacím z CLL, ale většina pacientů žije 5-10 let. S progresi nemoci stoupá exprese miR-155, která je označována jako oncomiR. MikroRNA (miRNA) představují negativní regulátory genové exprese. MiR-155 ovlivňuje geny, které se účastní leukemogeneze a buněčného cyklu. A je známo, že miR-155 (podobne jako i jiné miRNA) potlačuje své cíle. Předpokládali jsme, že úpravou genů v CLL bunkách odblokujeme cíle miR-155 a zjistíme korelaci mezi těmito cíli (známými a neznámými) s leukemogenezí CLL. Metody: Metodu, kterou jsme použili pro editaci genů, je CRISPR / Cas9, která umožňuje odstranit sekvenci maturované miR-155 v genomu leukemických B-buněk.K přenosu plasmidu CRISPR/Cas9 byla využita metoda nukleofekce. K identifikaci buněčných klonů s úspěšnou transfekcí plasmidu CRISPR/Cas9 došlo pomocí FACS a míra exprese jednotlivých genů byla měřena pomocí...
|
|
| |
host ::
RSS.