|
|
The role of ERK1 and ERK2 protein kinases in the MAPK/ERK signaling
Galvánková, Kristína ; Vomastek, Tomáš (vedoucí práce) ; Dráber, Peter (oponent)
MAPK/ERK je naprieč organizmami vysoko konzervovaná signálna dráha, zabezpečujúca procesy nevyhnutné pre život, akými sú proliferácia, diferenciácia, apoptóza alebo migrácia buniek. Všetky tieto procesy sú výsledkom spracovania celej rady extracelulárnych signálov prenášaných od receptorov cez kaskádu proteínkináz Raf, MEK a ERK pomocou následných fosforylácií. Raf fosforyluje MEK a MEK fosforyluje a aktivuje proteínkinázu ERK, ktorá následne fosforyluje a tým reguluje široké spektrum substrátov na rôznych miestach v bunke. Keďže ostatné dve proteínkinázy majú obmedzený počet substrátov, práve ERK fosforyláciou stoviek popísaných substrátov v daný moment zásadne vplýva na konečnú odpoveď bunky. Ovplyvnené substráty potom určujú výslednú bunkovú odpoveď na extracelulárny signál. Celá signálna dráha je v jednotlivých krokoch prísne regulovaná za pomoci interakčných partnerov a ďalších adaptorových proteínov. Nesprávna regulácia dráhy, ako aj mutácie jednotlivých proteínkináz vedú k závažným patologickým prejavom. Na úrovni proteínkinázy ERK sa vyskytujú dve izoformy, ERK1 a ERK2, ktoré sú z viac než 80 % identické. Ich veľká sekvenčná aj funkčná podobnosť vyvoláva otázky o ich evolučnej konzervovanosti a taktiež o tom, či majú tieto izoformy rozdielne funkcie, alebo sú funkčne zameniteľné. Cieľom...
|
|
|
Signaling effects of adenylate cyclase toxin action on phagocytes
Černý, Ondřej
Adenylát-cyklázový toxin (CyaA) je klíčovým faktorem virulence bakterie Bordetella pertussis. CyaA se váže na fagocyty produkující komplementový receptor 3 (CR3) a následně katalyzuje přeměnu vnitrobuněčného ATP na významného "druhého posla" cAMP. Tímto paralyzuje schopnost neutrofilů a makrofágů zabíjet bakterie pomocí oxidativního vzplanutí a mechanismů závislých na fagocytóze. V této práci analyzujeme mechanismus, kterým CyaA blokuje produkci baktericidních reaktivních kyslíkových a dusíkových radikálů neutrofily a makrofágy. CyaA potlačuje produkci reaktivních kyslíkových radikálů (ROS, z angl. "reactive oxygen species") jednak prostřednictvím inhibice PLC přes PKA a dále nejspíše ovlivněním skládání komplexu NADPH oxidázy prostřednictvím aktivace proteinu Epac. Selektivní aktivace PKA nebo Epac blokovala produkci ROS indukovanou fMLP. Inhibice PKA pomocí specifických inhibitorů navíc vedla jen k částečnému obnovení produkce ROS u neutrofilů vystavených CyaA. Signalizace CyaA/cAMP následně omezila tvorbu DAG, zatímco tvorba PIP3 zůstala neovlivněna. Tyto výsledky naznačují, že působení CyaA může ovlivnit lipidické složení membrány fagocytů. Dále jsme ukázali, že aktivace PKA pomocí cAMP vyvolává aktivaci tyrozínové fosfatázy SHP-1. To v makrofázích způsobí potlačení produkce reaktivních...
|
|
|
Analýza signální dráhy proteinkinasy StkP u Streptococcus pneumoniae
Holečková, Nela
Analýza signální dráhy proteinkinasy StkP u Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumonaie je nejen významný lidský patogen, ale také vhodný modelový organismus ke zkoumání buněčného dělení u ovoidních bakterií. Tato bakterie postrádá oba systémy výběru místa buněčného dělení Min a NO, a tedy mechanismus, jakým určuje místo, ve kterém nastane buněčné dělení, je neznámý. Navíc ve svém genomu kóduje jedinou serin/threoninovou proteinkinasu eukaryotického typu nazývanou StkP a jedinou serin/threoninovou proteinfosfatasu PP2C typu nazývanou PhpP. StkP je jedním z hlavních regulátorů buněčného dělení a pravděpodobně ovlivňuje průběh buněčného dělení i fosforylací svých substrátů, mezi které mimo jiné patří proteiny buněčného dělení FtsZ, FtsA, DivIVA, MacP, Jag/KhpB/EloR a LocZ/MapZ. První projekt této disertační práce se zabývá určením funkce proteinu LocZ v rámci buněčného dělení. Souhrnně, locZ sice není esenciální, ale účastní se procesu výběru místa dělení u S. pneumoniae a naše výsledky napovídají, že patří mezi pozitivní regulátory umístění Z-kruhu. Buňky s deplecí LocZ jsou schopny tvořit Z-kruh, ale ten je prostorově špatně umístěn, což má za následek defekty v buněčném dělení, deformity buněčného tvaru a tvorbu nerovnoměrně rozdělených dceřiných buněk, které občas neobsahují žádnou DNA. LocZ má...
|
|
|
Analýza signální dráhy proteinkinasy StkP u Streptococcus pneumoniae
Holečková, Nela
Analýza signální dráhy proteinkinasy StkP u Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumonaie je nejen významný lidský patogen, ale také vhodný modelový organismus ke zkoumání buněčného dělení u ovoidních bakterií. Tato bakterie postrádá oba systémy výběru místa buněčného dělení Min a NO, a tedy mechanismus, jakým určuje místo, ve kterém nastane buněčné dělení, je neznámý. Navíc ve svém genomu kóduje jedinou serin/threoninovou proteinkinasu eukaryotického typu nazývanou StkP a jedinou serin/threoninovou proteinfosfatasu PP2C typu nazývanou PhpP. StkP je jedním z hlavních regulátorů buněčného dělení a pravděpodobně ovlivňuje průběh buněčného dělení i fosforylací svých substrátů, mezi které mimo jiné patří proteiny buněčného dělení FtsZ, FtsA, DivIVA, MacP, Jag/KhpB/EloR a LocZ/MapZ. První projekt této disertační práce se zabývá určením funkce proteinu LocZ v rámci buněčného dělení. Souhrnně, locZ sice není esenciální, ale účastní se procesu výběru místa dělení u S. pneumoniae a naše výsledky napovídají, že patří mezi pozitivní regulátory umístění Z-kruhu. Buňky s deplecí LocZ jsou schopny tvořit Z-kruh, ale ten je prostorově špatně umístěn, což má za následek defekty v buněčném dělení, deformity buněčného tvaru a tvorbu nerovnoměrně rozdělených dceřiných buněk, které občas neobsahují žádnou DNA. LocZ má...
|
|
|
Role of post-translational modifications, O-GlcNAcylation and Phosphorylation, in neurodegenerative disorders and brain hypometabolism
Špundová, Tereza ; Růžička, Jiří (vedoucí práce) ; Čočková, Zuzana (oponent)
Post-translační modifikace jsou jedny z hlavních mechanismů, které významně zvyšují variabilitu funkce proteinů. O-GlcNAcylace a fosforylace patří mezi nejrozšířenější a nejvíce studované post-translační modifikace. Za fyziologických podmínek OGlcNAcylace působí jako metabolický senzor, který spojuje metabolismus glukózy s běžnou funkcí neuronů. Reverzibilní fosforylace je jedním z mechanismů, které mohou snížit metabolismus regulováním rychlosti toku metabolickými cestami. Poruchy regulace těchto modifikací jsou spojeny s neurodegenerativními poruchami a hypometabolismem. Práce se zaměřuje na korelaci těchto dvou modifikací, jejich vzájemný vztah a dopad na neurodegenerativní onemocnění a jiné fyziologické modely. Klíčová slova: hypometabolismus, OGlcNAcylace, fosforylace, post-translační modifikace, neurodegenrativní onemocnění, hibernace, kalorická restrikce, paměť, učení
|
|
|
Buněčné mechanizmy regulace kanálu TRPA1
Barvíková, Kristýna ; Vlachová, Viktorie (vedoucí práce) ; Hudeček, Jiří (oponent)
TRPA1 je teplotně citlivý iontový kanál z ankyrinové podrodiny Tranzientních Receptorových Potenciálových (TRP) receptorů. Tyto proteiny hrají významnou roli v převodu širokého spektra vnějších a vnitřních signálů. Kanál TRPA1, který je hojně exprimován v primárních aferentních neuronech, je významný převodník různých škodlivých a dráždivých podnětů a účastní se také detekce změn teploty. Podobně jako ostatní TRP kanály je TRPA1 tvořen čtyřmi podjednotkami, přičemž každá podjednotka obsahuje šest transmembránových segmentů (S1-S6) ohraničených cytoplazmatickým N- a C-koncem. V nativních tkáních je receptor TRPA1 regulován několika fosforylačními místy, která jsou významná z hlediska aktivity TRPA1 za fyziologických a různých patofyziologických podmínek. Za použití mutační metody jsme predikovali a prozkoumali roli potenciálních fosforylačních míst pro proteinkinasu C ve funkci TRPA1, která zvyšuje aktivitu tohoto receptoru. Naše výsledky identifikují rezidua, u kterých fosfomimikující mutace ovlivnila schopnost kanálu reagovat na napěťové a chemické podněty, zatímco mutace za alanin nebo glycin, která znemožňuje fosforylaci na daném místě, funkci kanálu neovlivnila. Identifikovali jsme serin 602 v rámci šestnácté N-koncové ankyrinové repetice, jehož substituce za aspartát překvapivě zcela blokovala...
|
|
|
Analýza signální dráhy proteinkinasy StkP u Streptococcus pneumoniae
Holečková, Nela ; Doubravová, Linda (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent) ; Petříčková, Kateřina (oponent)
Analýza signální dráhy proteinkinasy StkP u Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumonaie je nejen významný lidský patogen, ale také vhodný modelový organismus ke zkoumání buněčného dělení u ovoidních bakterií. Tato bakterie postrádá oba systémy výběru místa buněčného dělení Min a NO, a tedy mechanismus, jakým určuje místo, ve kterém nastane buněčné dělení, je neznámý. Navíc ve svém genomu kóduje jedinou serin/threoninovou proteinkinasu eukaryotického typu nazývanou StkP a jedinou serin/threoninovou proteinfosfatasu PP2C typu nazývanou PhpP. StkP je jedním z hlavních regulátorů buněčného dělení a pravděpodobně ovlivňuje průběh buněčného dělení i fosforylací svých substrátů, mezi které mimo jiné patří proteiny buněčného dělení FtsZ, FtsA, DivIVA, MacP, Jag/KhpB/EloR a LocZ/MapZ. První projekt této disertační práce se zabývá určením funkce proteinu LocZ v rámci buněčného dělení. Souhrnně, locZ sice není esenciální, ale účastní se procesu výběru místa dělení u S. pneumoniae a naše výsledky napovídají, že patří mezi pozitivní regulátory umístění Z-kruhu. Buňky s deplecí LocZ jsou schopny tvořit Z-kruh, ale ten je prostorově špatně umístěn, což má za následek defekty v buněčném dělení, deformity buněčného tvaru a tvorbu nerovnoměrně rozdělených dceřiných buněk, které občas neobsahují žádnou DNA. LocZ má...
|
|
|
Příprava lidské Ca2+/kalmodulin-dependentní proteinkinasy kinasy 2 fosforylované na Ser100 a Ser511
Koupilová, Nicola ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
4 Abstrakt Ca2+ /kalmodulin-dependentní proteinkinasa kinasy (CaMKK) jsou serin/threonin kinasy, které se účastní vápníkové signální dráhy, přičemž u savců byly popsány dvě isoformy CaMKK, CaMKK1 a CaMKK2. Při zvýšení intracelulární koncentrace vápenatých kationtů dochází k aktivaci CaMKK prostřednictvím vazby komplexu Ca2+ /kalmodulin na C-koncový segment CaMKK, což uvolní autoihibici přerušením interakcí autoinhibičního segmentu s aktivním centrem kinasy. Aktivované CaMKK následně fosforylují a aktivují proteinkinasy CaMK1 a CaMK4 a v případě CaMKK2 i AMPK. Aktivita CaMKK je dále regulována prostřednictvím fosforylace cAMP-dependentní proteinkinasou A (PKA). Tato fosforylace vytvoří dva vazebné motivy, které jsou rozpoznány regulačními proteiny 14-3-3. Předchozí studie ukázaly, že protein 14-3-3 udržuje fosforylovanou CaMKK1 v inhibovaném stavu tím, že blokuje defosforylaci inhibičního fosforylačního místa. Předpokládá se, že i CaMKK2 by mohla být regulována podobným způsobem. Nicméně úloha vazby proteinu 14-3-3 v regulaci CaMKK2 je nejasná. Pro studium tohoto komplexu je však nutné připravit rekombinantní CaMKK2, která bude plně fosforylována na obou 14-3-3 vazebných motivech. Hlavním cílem této bakalářské práce bylo optimalizovat protokol pro fosforylaci lidské CaMKK2 (rezidua 93-517) obsahující pouze...
|
|
|
Identifikace nových substrátů Ser/Thr proteinkinázy StkP
Kleinová, Simona ; Ulrych, Aleš (vedoucí práce) ; Konopásek, Ivo (oponent)
Streptococcus pneumoniae kóduje ve svém genomu jedinou unikátní serin/threoninovou proteinkinázu StkP a k ní příslušnou proteinfosfatázu PhpP. Tento signalizační pár fosforyluje/defosforyluje mnoho cílových proteinů zúčastněných v celé řadě buněčných procesů. Dosud však bylo charakterizováno pouze několik z nich. Analýzou globálního fosfoproteomu mutantního kmene na pozadí ∆stkP kmene byl identifikován fosfoprotein Spr0175 a určen fosforylovaný zbytek Thr7. Cílem této diplomové práce byla charakterizace tohoto nového substrátu. Byly připraveny ∆spr0175 mutantní kmeny na genetickém pozadí Rx a R6 divokých kmenů, u kterých byl monitorován růst a buněčná morfologie. Testované mutantní kmeny měly morfologické defekty znamenající pravděpodobnou účast Spr0175 v procesu buněčného dělení. V divokém kmeni D39 byla delece genu spr0175 neúspěšná, což znamená možnou esencialitu Spr0175 u kmene D39. Získané výsledky dále potvrzují, že je protein Spr0175 v in vitro i in vivo podmínkách modifikován na threoninu v pozici 7. V in vitro podmínkách byla také prokázána minoritní fosforylace na zbytku T4. V in vivo experimentu bylo pomocí koimunoprecipitace zároveň prokázáno, že protein Spr0175 vytváří oligomerní struktury. Dalším cílem diplomové práce byla buněčná lokalizace Spr0175. Fluorescenční mikroskopií bylo...
|
|
|
3D structures of phosphorylation
Kielarová, Anežka ; Novotný, Marian (vedoucí práce) ; Vařeková, Radka (oponent)
Fosforylace je běžná post-translační modifikace proteinů využívaná téměř ve všech buněčných procesech. Přidání fosfátové skupiny na vedlejší řetězec aminokyseliny může z důvodu velikosti fosfátové skupiny a jejího negativního náboje způsobit strukturní změny proteinu a ovlivnit proteinové interakce. Fosforylace také může vést ke změně proteinové funkce, aktivity, a dokonce umístění proteinu v rámci buňky. Experimentální studium fosforylačních míst je velmi časově a finančně náročné i dnes v době hmotnostní spektrometrie. Z tohoto důvodu je předmětem výzkumu mnoha bioinformatických vědeckých skupin predikce fosforylačních míst. Současné analýzy fosforylačních míst studovaly především nefosforylovaná fosforylační místa a rozdělení a zastoupení aminokyselin v jejich sekvenčním okolí. Protože ke specificitě proteinových kináz ale mohou přispívat i aminokyseliny sekvenčně sice vzdálené, ale strukturně blízké, byly v této práci studovány 3D strukturní vlastnosti fosforylačních míst. Zároveň byla poprvé rozsáhle zkoumána fosforylační místa ve fosforylovaném stavu a výsledky byly srovnány s fosforylačními místy v nefosforylovaném stavu. Fosforylační místa byla nalezena především ve smyčkách a na povrchu proteinů. Aminokyseliny v jejich okolí byly častěji hydrofilní, pozitivně nabité a méně blízko sebe než...
|
host ::
RSS.