|
|
Analýza signální dráhy proteinkinasy StkP u Streptococcus pneumoniae
Holečková, Nela
Analýza signální dráhy proteinkinasy StkP u Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumonaie je nejen významný lidský patogen, ale také vhodný modelový organismus ke zkoumání buněčného dělení u ovoidních bakterií. Tato bakterie postrádá oba systémy výběru místa buněčného dělení Min a NO, a tedy mechanismus, jakým určuje místo, ve kterém nastane buněčné dělení, je neznámý. Navíc ve svém genomu kóduje jedinou serin/threoninovou proteinkinasu eukaryotického typu nazývanou StkP a jedinou serin/threoninovou proteinfosfatasu PP2C typu nazývanou PhpP. StkP je jedním z hlavních regulátorů buněčného dělení a pravděpodobně ovlivňuje průběh buněčného dělení i fosforylací svých substrátů, mezi které mimo jiné patří proteiny buněčného dělení FtsZ, FtsA, DivIVA, MacP, Jag/KhpB/EloR a LocZ/MapZ. První projekt této disertační práce se zabývá určením funkce proteinu LocZ v rámci buněčného dělení. Souhrnně, locZ sice není esenciální, ale účastní se procesu výběru místa dělení u S. pneumoniae a naše výsledky napovídají, že patří mezi pozitivní regulátory umístění Z-kruhu. Buňky s deplecí LocZ jsou schopny tvořit Z-kruh, ale ten je prostorově špatně umístěn, což má za následek defekty v buněčném dělení, deformity buněčného tvaru a tvorbu nerovnoměrně rozdělených dceřiných buněk, které občas neobsahují žádnou DNA. LocZ má...
|
|
|
Analýza signální dráhy proteinkinasy StkP u Streptococcus pneumoniae
Holečková, Nela
Analýza signální dráhy proteinkinasy StkP u Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumonaie je nejen významný lidský patogen, ale také vhodný modelový organismus ke zkoumání buněčného dělení u ovoidních bakterií. Tato bakterie postrádá oba systémy výběru místa buněčného dělení Min a NO, a tedy mechanismus, jakým určuje místo, ve kterém nastane buněčné dělení, je neznámý. Navíc ve svém genomu kóduje jedinou serin/threoninovou proteinkinasu eukaryotického typu nazývanou StkP a jedinou serin/threoninovou proteinfosfatasu PP2C typu nazývanou PhpP. StkP je jedním z hlavních regulátorů buněčného dělení a pravděpodobně ovlivňuje průběh buněčného dělení i fosforylací svých substrátů, mezi které mimo jiné patří proteiny buněčného dělení FtsZ, FtsA, DivIVA, MacP, Jag/KhpB/EloR a LocZ/MapZ. První projekt této disertační práce se zabývá určením funkce proteinu LocZ v rámci buněčného dělení. Souhrnně, locZ sice není esenciální, ale účastní se procesu výběru místa dělení u S. pneumoniae a naše výsledky napovídají, že patří mezi pozitivní regulátory umístění Z-kruhu. Buňky s deplecí LocZ jsou schopny tvořit Z-kruh, ale ten je prostorově špatně umístěn, což má za následek defekty v buněčném dělení, deformity buněčného tvaru a tvorbu nerovnoměrně rozdělených dceřiných buněk, které občas neobsahují žádnou DNA. LocZ má...
|
|
|
Role of post-translational modifications, O-GlcNAcylation and Phosphorylation, in neurodegenerative disorders and brain hypometabolism
Špundová, Tereza ; Růžička, Jiří (vedoucí práce) ; Čočková, Zuzana (oponent)
Post-translační modifikace jsou jedny z hlavních mechanismů, které významně zvyšují variabilitu funkce proteinů. O-GlcNAcylace a fosforylace patří mezi nejrozšířenější a nejvíce studované post-translační modifikace. Za fyziologických podmínek OGlcNAcylace působí jako metabolický senzor, který spojuje metabolismus glukózy s běžnou funkcí neuronů. Reverzibilní fosforylace je jedním z mechanismů, které mohou snížit metabolismus regulováním rychlosti toku metabolickými cestami. Poruchy regulace těchto modifikací jsou spojeny s neurodegenerativními poruchami a hypometabolismem. Práce se zaměřuje na korelaci těchto dvou modifikací, jejich vzájemný vztah a dopad na neurodegenerativní onemocnění a jiné fyziologické modely. Klíčová slova: hypometabolismus, OGlcNAcylace, fosforylace, post-translační modifikace, neurodegenrativní onemocnění, hibernace, kalorická restrikce, paměť, učení
|
|
|
Buněčné mechanizmy regulace kanálu TRPA1
Barvíková, Kristýna ; Vlachová, Viktorie (vedoucí práce) ; Hudeček, Jiří (oponent)
TRPA1 je teplotně citlivý iontový kanál z ankyrinové podrodiny Tranzientních Receptorových Potenciálových (TRP) receptorů. Tyto proteiny hrají významnou roli v převodu širokého spektra vnějších a vnitřních signálů. Kanál TRPA1, který je hojně exprimován v primárních aferentních neuronech, je významný převodník různých škodlivých a dráždivých podnětů a účastní se také detekce změn teploty. Podobně jako ostatní TRP kanály je TRPA1 tvořen čtyřmi podjednotkami, přičemž každá podjednotka obsahuje šest transmembránových segmentů (S1-S6) ohraničených cytoplazmatickým N- a C-koncem. V nativních tkáních je receptor TRPA1 regulován několika fosforylačními místy, která jsou významná z hlediska aktivity TRPA1 za fyziologických a různých patofyziologických podmínek. Za použití mutační metody jsme predikovali a prozkoumali roli potenciálních fosforylačních míst pro proteinkinasu C ve funkci TRPA1, která zvyšuje aktivitu tohoto receptoru. Naše výsledky identifikují rezidua, u kterých fosfomimikující mutace ovlivnila schopnost kanálu reagovat na napěťové a chemické podněty, zatímco mutace za alanin nebo glycin, která znemožňuje fosforylaci na daném místě, funkci kanálu neovlivnila. Identifikovali jsme serin 602 v rámci šestnácté N-koncové ankyrinové repetice, jehož substituce za aspartát překvapivě zcela blokovala...
|
|
|
Analýza signální dráhy proteinkinasy StkP u Streptococcus pneumoniae
Holečková, Nela ; Doubravová, Linda (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent) ; Petříčková, Kateřina (oponent)
Analýza signální dráhy proteinkinasy StkP u Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumonaie je nejen významný lidský patogen, ale také vhodný modelový organismus ke zkoumání buněčného dělení u ovoidních bakterií. Tato bakterie postrádá oba systémy výběru místa buněčného dělení Min a NO, a tedy mechanismus, jakým určuje místo, ve kterém nastane buněčné dělení, je neznámý. Navíc ve svém genomu kóduje jedinou serin/threoninovou proteinkinasu eukaryotického typu nazývanou StkP a jedinou serin/threoninovou proteinfosfatasu PP2C typu nazývanou PhpP. StkP je jedním z hlavních regulátorů buněčného dělení a pravděpodobně ovlivňuje průběh buněčného dělení i fosforylací svých substrátů, mezi které mimo jiné patří proteiny buněčného dělení FtsZ, FtsA, DivIVA, MacP, Jag/KhpB/EloR a LocZ/MapZ. První projekt této disertační práce se zabývá určením funkce proteinu LocZ v rámci buněčného dělení. Souhrnně, locZ sice není esenciální, ale účastní se procesu výběru místa dělení u S. pneumoniae a naše výsledky napovídají, že patří mezi pozitivní regulátory umístění Z-kruhu. Buňky s deplecí LocZ jsou schopny tvořit Z-kruh, ale ten je prostorově špatně umístěn, což má za následek defekty v buněčném dělení, deformity buněčného tvaru a tvorbu nerovnoměrně rozdělených dceřiných buněk, které občas neobsahují žádnou DNA. LocZ má...
|
|
|
Příprava lidské Ca2+/kalmodulin-dependentní proteinkinasy kinasy 2 fosforylované na Ser100 a Ser511
Koupilová, Nicola ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
4 Abstrakt Ca2+ /kalmodulin-dependentní proteinkinasa kinasy (CaMKK) jsou serin/threonin kinasy, které se účastní vápníkové signální dráhy, přičemž u savců byly popsány dvě isoformy CaMKK, CaMKK1 a CaMKK2. Při zvýšení intracelulární koncentrace vápenatých kationtů dochází k aktivaci CaMKK prostřednictvím vazby komplexu Ca2+ /kalmodulin na C-koncový segment CaMKK, což uvolní autoihibici přerušením interakcí autoinhibičního segmentu s aktivním centrem kinasy. Aktivované CaMKK následně fosforylují a aktivují proteinkinasy CaMK1 a CaMK4 a v případě CaMKK2 i AMPK. Aktivita CaMKK je dále regulována prostřednictvím fosforylace cAMP-dependentní proteinkinasou A (PKA). Tato fosforylace vytvoří dva vazebné motivy, které jsou rozpoznány regulačními proteiny 14-3-3. Předchozí studie ukázaly, že protein 14-3-3 udržuje fosforylovanou CaMKK1 v inhibovaném stavu tím, že blokuje defosforylaci inhibičního fosforylačního místa. Předpokládá se, že i CaMKK2 by mohla být regulována podobným způsobem. Nicméně úloha vazby proteinu 14-3-3 v regulaci CaMKK2 je nejasná. Pro studium tohoto komplexu je však nutné připravit rekombinantní CaMKK2, která bude plně fosforylována na obou 14-3-3 vazebných motivech. Hlavním cílem této bakalářské práce bylo optimalizovat protokol pro fosforylaci lidské CaMKK2 (rezidua 93-517) obsahující pouze...
|
|
|
Identifikace nových substrátů Ser/Thr proteinkinázy StkP
Kleinová, Simona ; Ulrych, Aleš (vedoucí práce) ; Konopásek, Ivo (oponent)
Streptococcus pneumoniae kóduje ve svém genomu jedinou unikátní serin/threoninovou proteinkinázu StkP a k ní příslušnou proteinfosfatázu PhpP. Tento signalizační pár fosforyluje/defosforyluje mnoho cílových proteinů zúčastněných v celé řadě buněčných procesů. Dosud však bylo charakterizováno pouze několik z nich. Analýzou globálního fosfoproteomu mutantního kmene na pozadí ∆stkP kmene byl identifikován fosfoprotein Spr0175 a určen fosforylovaný zbytek Thr7. Cílem této diplomové práce byla charakterizace tohoto nového substrátu. Byly připraveny ∆spr0175 mutantní kmeny na genetickém pozadí Rx a R6 divokých kmenů, u kterých byl monitorován růst a buněčná morfologie. Testované mutantní kmeny měly morfologické defekty znamenající pravděpodobnou účast Spr0175 v procesu buněčného dělení. V divokém kmeni D39 byla delece genu spr0175 neúspěšná, což znamená možnou esencialitu Spr0175 u kmene D39. Získané výsledky dále potvrzují, že je protein Spr0175 v in vitro i in vivo podmínkách modifikován na threoninu v pozici 7. V in vitro podmínkách byla také prokázána minoritní fosforylace na zbytku T4. V in vivo experimentu bylo pomocí koimunoprecipitace zároveň prokázáno, že protein Spr0175 vytváří oligomerní struktury. Dalším cílem diplomové práce byla buněčná lokalizace Spr0175. Fluorescenční mikroskopií bylo...
|
|
|
3D structures of phosphorylation
Kielarová, Anežka ; Novotný, Marian (vedoucí práce) ; Vařeková, Radka (oponent)
Fosforylace je běžná post-translační modifikace proteinů využívaná téměř ve všech buněčných procesech. Přidání fosfátové skupiny na vedlejší řetězec aminokyseliny může z důvodu velikosti fosfátové skupiny a jejího negativního náboje způsobit strukturní změny proteinu a ovlivnit proteinové interakce. Fosforylace také může vést ke změně proteinové funkce, aktivity, a dokonce umístění proteinu v rámci buňky. Experimentální studium fosforylačních míst je velmi časově a finančně náročné i dnes v době hmotnostní spektrometrie. Z tohoto důvodu je předmětem výzkumu mnoha bioinformatických vědeckých skupin predikce fosforylačních míst. Současné analýzy fosforylačních míst studovaly především nefosforylovaná fosforylační místa a rozdělení a zastoupení aminokyselin v jejich sekvenčním okolí. Protože ke specificitě proteinových kináz ale mohou přispívat i aminokyseliny sekvenčně sice vzdálené, ale strukturně blízké, byly v této práci studovány 3D strukturní vlastnosti fosforylačních míst. Zároveň byla poprvé rozsáhle zkoumána fosforylační místa ve fosforylovaném stavu a výsledky byly srovnány s fosforylačními místy v nefosforylovaném stavu. Fosforylační místa byla nalezena především ve smyčkách a na povrchu proteinů. Aminokyseliny v jejich okolí byly častěji hydrofilní, pozitivně nabité a méně blízko sebe než...
|
|
|
Tau protein, a biomarker of Alzheimer's disease: in vitro phosphorylation and tau-reactive antibodies characterization
Hromádková, Lenka ; Bílková, Zuzana (vedoucí práce) ; Fialová, Lenka (oponent) ; Krejsek, Jan (oponent)
Tau protein je s mikrotubuly asociovaný protein, který se nachází v axonech neuronů. Je klíčovou molekulou podílející se významně na patogenezi Alzheimerovy nemoci (AN), která je nejčastější příčinou stařecké demence. Tau patří do skupiny tzv. přirozeně nesbalených proteinů postrádajících globulární strukturu a vysoce náchylných k post-translačním modifikacím. Za patologických podmínek je tau protein abnormálně modifikován a chybně sbalován, což v důsledku vede k jeho oligomerizaci a agregaci do párově helikálních filament, které jsou základní jednotkou neurofibrilárních klubek, histopatologických útvarů typických pro AN. Současné léky používané v léčbě AN neurodegenerativní procesy pouze zpomalují a lék zcela zastavující vlastní rozvoj nemoci stále chybí. V současnosti je velmi slibným a rozvíjejícím se terapeutickým přístupem imunoterapie. Testována je také imunomodulace pomocí intravenózních imunoglobulinových preparátů (IVIG), které obsahují velké množství přirozených protilátek běžně se vyskytujících u zdravé populace. Objevení přirozeně se vyskytujících protilátek reaktivních s tau proteinem (nTau-Ab) v tělních tekutinách u pacientů s AD, zdravých kontrol, i jejich přítomnost v IVIG preparátech odstartovaly snahy lépe pochopit jejich úlohu u AN a jejich potenciální terapeutické využití....
|
|
|
Úloha signální dráhy ERK v regulaci genů časné odpovědi
Chvalová, Věra ; Vomastek, Tomáš (vedoucí práce) ; Doubravská, Lenka (oponent)
Signální dráha ERK představuje evolučně konzervovaný mechanismus, který buňkám umožňuje vnímat extracelulární signály a převádět je v široké spektrum specifických intracelulár- ních odpovědí, jako je proliferace, diferenciace, apoptóza či buněčná migrace. Mezi klíčové prvky této dráhy patří proteinkinázy Raf, MEK a efektorová proteinkináza ERK. Konstitutivní aktivace dráhy ERK, způsobená somatickými mutacemi některých jejích členů, se často objevuje u mnoha typů lidských nádorových onemocnění. Tato dráha proto hraje významnou roli i z biomedicín- ského hlediska. Zmíněné fyziologické i patologické děje jsou podmíněny především schopností signální dráhy ERK regulovat změny v expresi velkého množství genů. Po aktivaci proteinkinázy ERK dochází k její translokaci do jádra, kde fosforyluje rozličné transkripční faktory. To vede k jejich aktivaci a následně k několikastupňovým změnám v genové expresi. Nejdříve dochází k tran- skripci genů tzv. časné odpovědi (immediate early genes; IEGs), z nichž mnoho kóduje další tran- skripční faktory, jako jsou c-Fos, c-Jun či c-Myc. Ty následně regulují expresi genů tzv. sekun- dární odpovědi (secondary response genes, SRGs), které kódují další strukturní či signalizační proteiny. Hromadné změny v genové expresi poté vedou k funkčnímu přeprogramování buněk. V této...
|
host ::
RSS.