|
|
Příprava syntetických modifikovaných messenger RNA genů kódující regulátory buněčného cyklu
Petroušek, Filip ; Koblas, Tomáš (vedoucí práce) ; Vašková, Michaela (oponent)
Jedním z moderních léčebných postupů je aplikace in vitro transkribované mRNA do cílových buněk za účelem tvorby požadovaných proteinů. Zmíněná metoda se ukázala být daleko efektivnější než terapeutické podání již předem připravených proteinů, kde při jejich vpravení do organismu docházelo k denaturaci. Hlavní náplní této práce byla in vitro příprava mRNA, její následná trasfekce do buněk Langerhansových ostrůvků a detekce exprese cílových proteinů pomocí metody Western blot. Konktrétně se jednalo o proteiny z rodin cyklinů a cyklin dependentních kináz (CDK), které hrají významnou roli v regulaci buněčného cyklu. Celkem byla připravena mRNA pro 8 molekul, mezi které patřily nemutované formy cyklinů D1, D2 a D3 a cyklindependentní kináza 6, dále pak mutované verze cyklinů D1 T286AT288A, D2 T280A, D3 T283A a cyklin dependentní kináza 4 R24C. U cyklinů se jednalo o záměnu aminokyseliny threoninu za alanin. Tato záměna má za následek zpomalení degradace proteinu ve srovnání s přirozeně se vyskytující formou. Pro cyklin dependentní kinázu 4 záměna aminokyseliny argininu za cystein také spočívá ve zvýšení její stability in vivo. Připravená mRNA kódující uvedené regulátory buněčného cyklu byla transfekována do buněk Langerhansových ostrůvků izolovaných z potkaního pankreatu. Tato metoda by mohla v...
|
|
|
Stimulace proliferace beta-buněk pankreatu pomocí syntetických modifikovaných mRNA kódující geny regulátorů buněčného cyklu
Ivanovská, Dana ; Koblas, Tomáš (vedoucí práce) ; Černá, Věra (oponent)
je metabolické onemocnění, které se projevuje dlouhodobě zvýšenou krvi. Hyperglykémie je způsobena ztrátou pankreatických inzulín produkujících beta buněk. V případě diabetu mellitu II. typu bývá také spojena Z toho důvodu by náhrada nebo regenerace beta buněk pacientů. V současné době se vědecký výzkum zaměřuje stimulaci proliferace pankreatických beta buněk. potenciálně vhodné molekuly pro indukci proliferace beta buněk. Tyto proteiny řídí vstup buňky do buněčného cyklu. Cílem této bakalářské práce bylo ověřit možnost navození proliferace beta buněk prostřednictvím synteticky připravených mRNA cyklinů typu D syntetizovaných mRNA umožnuje krátkodobě zvýšenou expresi příslušných proteinů. Dále byly také využity mutované formy cyklinů D, které vyznačují vyšší stabilitou a tedy i delším poločasem života. Po transfekci sociovaných Langerhansových ostrůvků byla detekována přítomnost cyklinů typu D Cdk4/6 metodou nepřímé imunofluorescence. Současně byla také provedena metoda Western blotu s následnou imunodetekcí proteinů. Transfekce potkaních Langerhansových ostrůvků rů pro cykliny typu D s Cdk4/6 vedla ve všech případech k výrazné indukci proliferace potkaních beta buněk. Míra proliferace se pohybovala v rozmezí − kombinaci transfekovaných syntetických mRNA, kdežto u kontrolní netransfekovaných beta buněk byla...
|
|
|
Studium exprese genů v živočišných tkáních metodou real-time PCR
Valentová, Šárka
Studium genové exprese v živočišných tkáních umožňuje lepší porozumění fyziologie živočichů, díky kterému pak můžeme expresi genů kontrolovat či regulovat. Kvantitativní polymerázová reakce v reálném čase (real-time PCR), která studium genové exprese umožňuje, je vysoce flexibilní metodou. V současné době je k dispozici celá řada variant této technologie dle použité chemie a instrumentace. Optimální výsledky studií genové exprese vyžadují jasné pochopení této metody a přehled dostupných variant. Předkládaná bakalářská práce stručně popisuje metodu real-time PCR a jednotlivé varianty pro jejich následné srovnání z hlediska vhodnosti pro jednotlivé typy analýz a shrnuje význam studií exprese genů v biotechnologiích i klinické praxi. Dále je prakticky srovnána citlivost a zároveň výkonnost kvantifikačních přístrojů 7500 Real-Time PCR SYSTEM a Rotor-Gene Q. Porovnávány byly střední hodnoty naměřených Ct hodnot pomocí párového t-testu. Na základě výsledných dat je možné říci, že mezi přístroji není statisticky významný rozdíl, co se týče citlivosti a výkonnosti.
|
|
| |
|
|
Preparation of nanoparticles for hepatitis B viral therapy
Kružíková, Zuzana ; Grantz Šašková, Klára (vedoucí práce) ; Žáčková Suchanová, Jiřina (oponent)
Virus hepatitidy B (HBV) je v současné době cílem zájmů na poli základního i farmaceutického výzkumu. Účinná vakcína proti HBV byla vyvinuta již v roce 1982, přesto je však světová prevalence tohoto onemocnění stále vysoká. Chronická infekce HBV může vést k významnému poškození jater a postupně až ke vzniku hepatocelulárního karcinomu. Pro chronickou infekci ovšem stále neexistuje vhodná léčba, jelikož virový genom zůstává v jádře infikovaného hepatocytu ukryt imunitnímu systému ale i antivirovým léčivům. Jedna z nových strategií pro léčbu HBV předpokládá, že virová cccDNA by mohla být zničena pomocí nástrojů genové editace jako je CRISPR/Cas9 systém. Aby mohl být tento systém pro genovou editaci uveden do klinické praxe, CRISPR/Cas9 musí být specificky dopraven do cílových buněk, aby se minimalizovalo riziko štěpení DNA mimo cílené sekvence. Tato diplomové práce se zabývá zaprvé návrhem nových sgRNA mířených proti cccDNA viru hepatitidy B a testování jejich účinnosti a zadruhé tato práce popisuje modulární lipidové nanočástice vyvinuté speciálně pro dopravu CRISPR/Cas9 ve formě RNA. Klíčová slova: virus hepatitidy B, CRISPR/Cas9, editace genů, lipidové nanočástice, dopravování mRNA, cílené dopravování
|
|
|
Identification of key regulators of gene expression in mammalian oocyte and embryo
Jansová, Denisa ; Šušor, Andrej (vedoucí práce) ; Gahurová, Lenka (oponent) ; Lin, Chih-Jen Lance (oponent)
Souhrn práce Savčí oocyt je vysoce diferencovaná buňka, ze které po oplození vzniká embryo. Na konci růstové fáze se plně dorostlý oocyt stává transkripčně inaktivním. Během následujících fází vývoje oocytu, tedy během jeho zrání, oplození a následně během časného embryonálního vývoje, jsou využívány pouze transkripty nasyntetizované v růstové fázi oogeneze, které oocyt skladuje k pozdějšímu využití. Distribuce mRNA je úzce svázána s lokalizací a funkcí proteinu, který kóduje. Tohoto mechanismu regulace genové exprese využívají různé typy buněk. Zatím ovšem není mnoho známo o lokalizaci mRNA molekul a jejich translaci v savčím oocytu a časném embryu. Cílem této práce bylo detekovat celkový transkriptom a komponenty translačního aparátu v savčím oocytu a dvoubuněčném embryu a odhalit mechanismus regulující translaci, která je důležitá pro správný vývoj oocytu a embrya. Ukázali jsme, že jádro myšího i lidského oocytu obsahuje RNA molekuly a RNA vazebné proteiny. Po rozpadu jaderné membrány dochází k translaci v oblasti chromosómů. Předpokládáme, že molekuly mRNA, které jsou přítomny v jádře oocytu, jsou následně po rozpadu jaderné membrány zpřístupněny translačnímu aparátu a dochází k jejich translaci a vzniku proteinů, které jsou důležité pro správný průběh meiotického zrání oocytu a časného embryonálního...
|
|
|
Characterization of eukaryotic translation initiation factor 3 subunits (eIF3) in A. thaliana male gametophyte
Linhart, Filip ; Hafidh, Said (vedoucí práce) ; Retzer, Katarzyna (oponent)
Od RNA k proteinu je iniciace translace a proteosyntéza zprostředkovávaná trans-vazebnými faktory, jež rozeznávají charakteristiky mRNA, společná téměř všem eukaryotům. Komplex tvořící eukaryotický translační iniciační faktor 3 (eIF3) je vysoce konzervovaným proteinovým komplexem, který rozpoznává složky 5' čepičky mRNA za cílem iniciace translace. eIF3 se skládá z devíti podjednotek, z nich tři mají dvě izoformy: eIF3A, eIF2B1, eIF3B2, eIF3C1, eIF3C2, eIF3D, eIF3E, eIF3F, eIF3G1, eIF3G2, eIF3H a eIF3K. Tato práce se zabývá funkční charakterizací, expresí a subcelulární lokalizací eIF3B1, eIF3B2 a eIF3E v samčím gametofytu Arabidopsis thaliana a interakcí eIF3E s komplexem Constitutive photomorphogenesis 9 (COP9) ve funkci regulačního komplexu posttranslační kontroly eIF3E. Ukazujeme, že ztráta funkce eif3b1 či eif3b2 se neprojevuje gametofytickou letalitou a že tyto dva proteiny se zřejmě funkčně doplňují, zatímco mutace eif3e má za důsledek letalitu samčího gametofytu. Pouze eif3b1 projevuje defekty následně po oplodnění, během vývoje semene. Studie genové exprese, užívající veřejně dostupná data o expresi a promotorové aktivitě prokazují vysokou úroveň exprese podjednotek eIF3 v zónách s intenzivním buněčným dělením, tedy listového primodia, kořenového meristému a elongační zóny, taktéž jako ve...
|
|
| |
|
| |
|
|
Design siRNA a vliv modifikací na jejich stabilitu a účinnost
Kuldanová, Kateřina ; Vopálenský, Václav (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
Návrh krátkých interferujících RNA (siRNA) je základním krokem k úspěšné RNA interferenci (RNAi). Navrhnout vhodný siRNA duplex ale není zcela triviální, neboť existuje několik problematických oblastí, jako jsou například stabilita siRNA duplexů v přítomnosti nukleáz, účinnost eliminace cílové mRNA, sekvenčně specifická eliminace necílových mRNA, cytotoxicita a imunogenicita, ovlivňujících funkčnost siRNA duplexů a tedy i jejich využitelnost v medicíně a dalších oborech. Porozumění principům fungování siRNA duplexů při RNAi je nezbytným krokem k vyřešení výše uvedených překážek na cestě k účinným léčivům. Prostředkem optimalizace popsaných vlastností je úprava návrhu siRNA duplexů pomocí různých modifikací. Modifikovat lze fosfodiesterovou kostru, báze i ribózu. V každé z těchto skupin jsou známy modifikace, které mají na siRNA duplexy a následnou RNA interferenci pozitivní vliv. Tato práce předkládá dosavadní poznatky o několika nejznámějších modifikacích, jako jsou thiofosfátová substituce, 2′-deoxy-2′-fluoronukleotidy, 2′-O-methyl ribonukleotidy a LNA nukleotidy, a o větším počtu méně známých modifikací, jako jsou boranofosfátová substituce, 4′-thioribonukleotidy, 2′-O-methyl-dithiofosfátová modifikace a mnoho dalších, které ovlivňují vlastnosti siRNA duplexu.
|
host ::
RSS.