|
|
Tandemová hmotnostní spektrometrie sfingolipidů s aplikací pro metabolické studie a diagnostiku sfingolipidos
Kuchař, Ladislav
V posledních letech se hmotnostní spektrometrie (MS) stala dominantní technologií používanou při lipidomické analýze a silně ovlivnila výzkum a diagnostiku onemocnění lipidního metabolismu jako např. lysosomální střádavá onemocnění (LSD) charakterisovaná poruchami funkcí lysosomů. Soubor poruch lysosomální degradace sfingolipidů (SFL) přísluší ke skupině sfingolipidos. Tento stav má vážné až fatální klinické důsledky. Prvotním cílem práce bylo zavedení kvantitativní a kvalitativní analýzy SFL pro výzkum a diagnostiku LSD. Na jejím počátku bylo třeba připravit semisynthesou lipidní hmotnostně značené standardy pomocí imobilizované sfingolipid ceramid N-deacylasy. Zavedené metody kvantitativní analysy byly posléze použity k průkazu zvýšené exkrece močových SFL u LSD s charakteristickým střádáním v ledvinách. Vyhodnocení SFL vylučovaných močí prokázalo svůj význam při diferenciální diagnostice deficitu prosaposinu a saposinu B kdy rutinní enzymologie selhává. MS navíc umožňuje sledování jednotlivých molekulárních druhů SFL (isoforem), jenž vedlo ke zjištění, že u některých LSD se jejich profil v moči mění. To následně vedlo k vývoji nové screeningové metody v suchém vzorku moče založeném na vyhodnocování profilu isoforem. Další aplikací MS byla analýza pitevních vzorků tkání nebo buněk u nevyjasněných...
|
|
|
Pathology and physiology of de novo purine synthesis.
Krijt, Matyáš ; Zikánová, Marie (vedoucí práce) ; Šebesta, Ivan (oponent) ; Čajka, Tomáš (oponent)
Puriny jsou organické sloučeniny s rozmanitými funkcemi, které se nacházejí ve všech živých organismech ve složitých molekulách, jako jsou nukleotidy, nukleosidy nebo jako purinové báze. Jejich přirozená rovnováha v organismu je udržována syntézou, recyklací a degradací. Přebytek purinů se vylučuje močí jako kyselina močová. Purinové nukleotidy mohou být recyklovány záchrannými cestami, které katalyzují reakci purinové báze s fosforibosylpyrofosfátem. Zcela nová ústřední molekula purinového metabolismu, inosinmonofosfát, může být syntetizována z prekurzorů při de novo purinové syntéze (DNPS), která je aktivována v případech zvýšené potřeby purinů jako je např. vývoj organismu. DNPS zahrnuje deset kroků katalyzovaných šesti enzymy, které formují multienzymový komplex purinosom umožňující tok substrátů skrz tuto dráhu. Dosud byly popsány tři poruchy DNPS: deficit ADSL, AICA-ribosidurie a deficit PAICS. Všechny tři poruchy jsou způsobeny genetickými mutacemi vedoucími ke špatné funkci příslušného enzymu, které se dále projevují nedostatečnou aktivitou daného kroku DNPS. Biochemicky to znamená akumulaci substrátu poškozeného enzymu, biologicky narušení formování purinosomu a klinicky nespecifická neurologická postižení, což přispívá k problematické diagnostice poruch DNPS. Předpokládali jsme, že...
|
|
|
Využití LC-MS/MS v diagnostice kongenitální adrenální hyperplasie
Grúlová, Kristýna ; Kozlík, Petr (vedoucí práce) ; Jelínek, Ivan (oponent)
Kongenitální adrenální hyperplasie (CAH) je autozomálně recesivní onemocnění, které způsobuje poruchu steroidogeneze v kůře nadledvinek. Tato choroba je součástí panelu nemocí vyhledávaných v rámci preklinického celorepublikového novorozeneckého screeningu. Metodika je založená na měření koncentrace 17-hydroxyprogesteronu (17-OHP) v suché krevní kapce pomocí fluorescenční imunoanalýzy (FIA). Toto stanovení není však zcela specifické a generuje vysoké množství falešně pozitivních výsledků (až 4,3 %). V rámci této diplomové práce byla vyvinuta LC-MS/MS metoda, kterou byly změřeny vybrané steroidní hormony, které jsou aktivní v metabolismu kortisolu s ohledem na diagnostiku onemocnění CAH. Metoda byla validována a aplikována na klinické vzorky, kde rozpoznala pacienty od negativních kontrol a zásadně zredukovala falešnou pozitivitu výsledků novorozeneckého screeningu. Oproti výsledkům FIA snížila LC-MS/MS metoda falešnou pozitivitu až o 50 % v hodnocení koncentrace 17-OHP. Rozšířením diagnostického algoritmu o další naměřené markery pak došlo k redukci až o 98 %. Vyvinutá metoda je aplikovatelná též pro měření vzorků krevního séra, respektive plazmy a stala se součástí konfirmace suspektních nálezů screeningu CAH. Klíčová slova: Steroidní hormony, kongenitální adrenální hyperplasie, suchá krevní...
|
|
| |
|
|
Využití vysokoúčinných separačních metod pro analýzy biologicky aktivních látek
Adamusová, Hana ; Bosáková, Zuzana (vedoucí práce) ; Jelínek, Ivan (oponent) ; Tůma, Petr (oponent)
V rámci první části disertační práce byla vypracována nová analytická metoda HPLC-MS/MS pro sledování koncentračních změn 17β-estradiolu (βE2) během kapacitace myších spermií in vitro. Kapacitace byla prováděna se třemi počátečními koncentracemi βE2 (200, 20 a 2 μg/L). Pro všechny koncentrace byl pozorován obdobný trend závislosti koncentrace nevázaného βE2 na čase kapacitace. Koncentrace βE2 se snižovala, aby dosáhla svého minima a poté se opět zvyšovala. Pozice minima se lišila pro jednotlivé testované koncentrace βE2. Experimentálně získané výsledky byly podrobeny kinetické analýze. Křivky proložené experimentálně získanými body vykazovaly autokatalytický charakter. Pro shodu mezi křivkami, získanými proložením experimentálními body, a teoreticky vypočítanými křivkami je nutné předpokládat, že prvním krokem je adsorpce βE2 na povrch spermií řízená Langmuirovou izotermou. Kinetická studie byla použita i pro studium působení fluoridů a fluorohlinitých komplexů na kapacitaci myších spermií. Bylo zjištěno, že teoreticky získané křivky vykazují velmi dobrou shodu s experimentálně získanými body, tento fakt potvrzuje mechanismus kinetiky kapacitace myších spermií. Ve druhé části této disertační práce byly vyvinuty dvě analytické metody pro chirální separaci aclidinium bromidu (AB) a tapentadolu...
|
|
| |
|
| |
|
| |
|
| |
|
| |
host ::
RSS.