|
| |
|
| |
|
|
Studium poškození DNA pomocí PCR
Jansová, Adéla ; Jirkovská, Anna (vedoucí práce) ; Matoušková, Petra (oponent)
Abstakt Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra Biochemických věd Kandidátka: Bc. Adéla Jansová Školitel: PharmDr. Anna Jirkovská, Ph.D. Název diplomové práce: Studium poškození DNA pomocí PCR Klíčová slova: funkce DNA, DNA poškození, PCR, SINE elementy Předávání genetické informace budoucím generacím je možné díky replikaci DNA za pomoci enzymů, hlavně DNA polymerasy. Nejdůležitější funkcí DNA je biosyntéza proteinů, které vykonávají specifické funkce v celé buňce. Kódující DNA sekvence jsou zdrojem pro syntézu proteinů. Ty vznikají transkripcí dané sekvence za pomoci RNA polymerasy a následně jsou translací přeloženy na aminokyseliny. Nekódující sekvence mají hlavně regulační funkce, jsou to funkční molekuly DNA (rRNA, tRNA, snRNA) a regulační oblasti (promotory, zesilovače a tlumiče), dále také transpozony (SINE, LINE) a pseudogeny. Poškození DNA způsobuje UV záření, ionizační záření, chemické látky (léky na bázi cisplatiny, alkylační látky, apod.), reaktivní formy kyslíku a také dochází k poškození DNA deaminací bází. Při poškození se aktivují opravné procesy, které odstraňují chybné párování, addukty a zlomy. Pokud se nepodaří poškození odstranit opravnými procesy, dochází k tvorbě mutací, senescenci nebo buněčné smrti. Stanovit poškození DNA je možné několika metodami podle...
|
|
|
Role WSS1 proteasy v DNA reparačních procesech kvasinkové buňky.
Adámek, Michael ; Grantz Šašková, Klára (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
Zachování integrity DNA je v průběhu života kritické pro každý živý organismus. Organismy si proto vyvinuly mnoho způsobů, jak detekovat a opravit různé typy poškození DNA, způsobené endogenními i exogenními vlivy, vyúsťující dále v replikační stres. Chyby v těchto opravných mechanismech mohou vést k závažným lidským onemocněním, jako jsou neurologické poruchy, familiární druhy onkologických onemocnění nebo vývojové syndromy. V této diplomové práci byla zkoumána funkce kvasinkového proteinu Wss1, metaloproteasy, která se podílí na nedávno objevené DNA opravné dráze, která proteolyticky odstraňuje proteiny kovalentně zachycené na zuje silnou negativní interakci s jinou proteasou opravující DNA, Ddi1, přičemž bylo objeveno, že kvasinkový kmen postrádající současně geny je hypersenzitivní na hydroxyureu. Hydroxyurea inhibuje ribonukleotidreduktasu, čímž v konečném důsledk způsobuje zastavení buňky v fázi buněčného cyklu. V rámci této diplomové práce byly na základě předchozích studií provedeny tzv. "rescue" experimenty s různými variantami Wss1, postrádajícími jednotlivé domény či obsahujícími bodové aminokyselinové záměny. Tyto experimenty následně posloužily k posouzení účasti jednotlivých domén proteinu Wss1 v odpovědi na replikační stres vyvolaný hydroxymočovinou.
|
|
|
Novel Approaches in Electrochemical Determination of Xenobiotic Compounds and in Study of Their Interaction with DNA
Hájková, Andrea ; Vyskočil, Vlastimil (vedoucí práce) ; Trnková, Libuše (oponent) ; Labuda, Ján (oponent)
Předložená disertační práce je zaměřena na vývoj analytických metod pro stanovení vybraných cizorodých látek a ke sledování poškození DNA, které mohou způsobit. Hlavní pozornost byla věnována vývoji a testování netoxických elektrodových materiálů pro přípravu miniaturizovaných elektrochemických zařízení a nových elektrochemických DNA biosenzorů. 2-Aminofluoren-9-on (2-AFN) byl vybrán jako modelový polutant životního prostředí, který patří do skupiny nebezpečných genotoxických látek. Jeho karcinogenní a mutagenní účinky mohou představovat riziko jak pro životní, tak pro pracovní prostředí. 2-AFN má oxo skupinu, kterou lze elektrochemicky redukovat, a aminoskupinu, kterou lze elektrochemicky oxidovat. Voltametrické chování 2-AFN v negativní oblasti potenciálu bylo zkoumáno na rtuťovým meniskem modifikované stříbrné pevné amalgamové elektrodě (m-AgSAE), která představuje netoxickou a mechanicky stabilní alternativu ke rtuťovým elektrodám. Tato pracovní elektroda byla následně použita pro vývoj nově navrženého miniaturního elektrodového systému (MES), který má mnoho výhod, jako je možnost jednoduchého měření v terénu, snadná přenosnost a měření ve 100µL objemu vzorku. Také elektroda ze skelného uhlíku (GCE) byla použita pro další výzkum elektrochemického chování 2-AFN a jeho stanovení v katodické i...
|
|
|
Mercury Electrodes as Tools for Voltammetric Determination of Biologically Active Organic Compounds and for Detection of Their Interaction with DNA
Horáková, Eva ; Vyskočil, Vlastimil (vedoucí práce) ; Ludvík, Jiří (oponent) ; Vytřas, Karel (oponent)
Hlavní cílem této dizertační práce bylo využití pro voltametrickou analýzu tradičních rtuťových elektrod k vývoji elektroanalytických metod stanovení organických xenobiotik a ke studiu jejich interakce s dvouvláknovou deoxyribonukleovou kyselinou (DNA). V návaznosti na můj předchozí výzkum (vedený v rámci mé diplomové práce) byl prvním zkoumaným analytem 4-nitrobifenyl (4-NBP), který je podezřelý z karcinogenity. Interakce DNA se 4-NBP byla studována diferenční pulzní voltametrií (DPV), cyklickou voltametrií (CV) a chronocoulometrií na visící rtuťové kapkové elektrodě (HMDE), a dále s využitím CV a AC voltametrie (voltametrie se střídavým potenciálem) na DNA modifikované HMDE. Pomocí CV byl studován mechanismus redukce 4-NBP. Dále byla věnována pozornost studiu interakce DNA se 4-aminobifenylem (4-ABP), metabolitem 4-NBP, a s meziprodukty redukce 4-NBP. Bylo zjištěno, že vlivem interakce DNA se 4-NBP a 4-ABP dochází ke vzniku agregátů DNA s těmito analyty. Druhým studovaným analytem byla methylová violeť 2B (MV). Ke stanovení MV v pufrovaném roztoku byly použity DC tast polarografie a diferenční pulzní polarografie na kapající rtuťové elektrodě (DME) a DC voltametrie, DPV a diferenční pulzní adsorpční rozpouštěcí voltametrie (DPAdSV) na HMDE. Nejnižší mez stanovitelnosti (13 nmol L−1 ) byla...
|
|
|
Detekce kovalentních komplexů DNA s proteiny jako metoda stanovení poškození DNA topoizomerázovými jedy.
Karešová, Aneta ; Jirkovská, Anna (vedoucí práce) ; Fikrová, Petra (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra Biochemických věd Kandidát: Aneta Karešová Školitel: PharmDr. Anna Jirkovská, Ph.D. Název diplomové práce: Detekce kovalentních komplexů DNA s proteiny jako metoda stanovení poškození DNA topoizomerázovými jedy Topoizomeráza II je enzym modifikující sekundární strukturu DNA. Pomocí zavedení dočasného dvojitého zlomu DNA umožňuje rozvolnění zvýšené tenze v DNA vznikající např. při transkripci a translaci DNA. Naprosto nezastupitelnou roli má i při uvolnění sesterských chromatid po replikaci DNA v S-fázi buněčného cyklu. Mechanismem katalytické reakce je tvorba kovalentního komplexu mezi aminokyselinami tyrozinem v aktivním místě enzymu a 5' fosfátovou skupinou na obou vláknech DNA, což následně umožní otevření řetězců a průchod druhé části DNA a poté jsou za současného uvolnění topoizomerázy II přerušená vlákna opětovně spojena. Nezbytnost topoizomerázové aktivity převážně pro proliferující buňky činí z tohoto enzymu vynikající cíl protinádorové terapie a látky patřící do skupiny inhibitorů topoizomerázy II (etoposid, antracyklinová antibiotika) jsou jedny z nejúčinnějších protinádorových léčiv v klinické praxi. Svým působením stabilizují kovalentní komplex DNA s topoizomerázou II a znemožňují opětovné spojení rozdělených...
|
|
|
Potenciální využití WIP1 fosfatasy v terapii nádorového onemocnění prsu
Pecháčková, Soňa ; Macůrek, Libor (vedoucí práce) ; Souček, Pavel (oponent) ; Krejčí, Lumír (oponent)
(Czech) Buňky našeho těla reagují na genotoxický stres aktivací signální dráhy, která se nazývá buněčná odpověď na poškození DNA (DNA damage response; DDR). V závislosti na typu poškození DNA, DDR dráha vede k dočasnému zastavení buněčného cyklu v kontrolních bodech (tzv. checkpointech), trvalému zastavení růstu (senescence) nebo k programované buněčné smrti (apoptóza). Aktivace kontrolních bodů buněčného cyklu brání progresi buněk a usnadňuje opravu poškozené DNA. DDR představuje bariéru před nárůstem genomové nestability a chrání buňky před vznikem rakoviny. WIP1 (kódovaná genem PPM1D) fosfatasa je hlavním negativním regulátorem DDR dráhy a je nezbytná pro ukončení kontrolních bodů buněčného cyklu. Tato práce přispěla k pochopení molekulárních mechanismů funkce WIP1 fosfatasy a popisuje, jak může být WIP1 fosfatasa zapojena při vzniku nádorů. Nejprve jsme popsali, že hladina WIP1 klesá během mitózy pomocí APC-Cdc20 komplexu, který způsobuje proteasomální degradaci proteinu. WIP1 je v průběhu mitózy fosforylovaná na několika aminokyselinách, což vede k inhibici její enzymatické aktivity. Navrhujeme, že inhibice WIP1 v mitóze umožňuje reagovat na nízkou hladinu DNA poškození, ke které dochází v průběhu nenarušené mitózy. Dále jsme identifikovali nové aktivační (gain-of-function) mutace genu PPM1D,...
|
|
|
Defects in DNA repair and RNA metabolism associated with human neurological disorders
Cihlářová, Zuzana ; Hanzlíková, Hana (vedoucí práce) ; Čermák, Lukáš (oponent) ; Roithová, Adriana (oponent)
Lidský genom neustále podléhá vlivům vnějšího a vnitřního prostředí, které přímo či nepřímo poškozují DNA a mohou dále narušovat buněčné procesy, mimo jiné i metabolismus RNA. Buňky však disponují řadou mechanismů, jak tato DNA poškození rychle opravit, což zdůrazňuje význam integrity a stability genomu. Chybná oprava DNA a poruchy v metabolism RNA mohou vést k degeneraci neuronů, predispozici k rakovině a zvýšenému výskytu dědičných genetických onemocnění. Mutace v proteinu BRAT1 (s BRCA1 asociovaný ATM aktivátor-1) způsobují neurologická onemocnění, která se projevují různě závažnými klinickými fenotypy. Tato heterogenita sahá od těžkého průběhu, který se projevuje mikrocefalií, hypertonií, epilepsií, záchvaty a brzkým úmrtím jedince, zpravidla do dvou let od narození. Naopak mírnější forma BRAT1-asociovaného onemocnění je charakterizována převážně cerebelární atrofií a ataxií. Některé studie naznačují možnou úlohu proteinu BRAT1 během oprav dvojřetězcových zlomů DNA, a to zejména prostřednictvím jeho účasti při aktivaci ATM kinázy. Dosud však není jasné, jakým způsobem mutace v genu BRAT1 přispívá k degeneraci neuronů. V rámci tohoto projektu jsme se tudíž zaměřili na studium role BRAT1 v buňkách pacientů, kteří vykazují degeneraci neuronů způsobenou homozygotní missense c.185T>A (p.Val62Glu)...
|
|
|
Mercury Electrodes as Tools for Voltammetric Determination of Biologically Active Organic Compounds and for Detection of Their Interaction with DNA
Horáková, Eva
Hlavní cílem této dizertační práce bylo využití pro voltametrickou analýzu tradičních rtuťových elektrod k vývoji elektroanalytických metod stanovení organických xenobiotik a ke studiu jejich interakce s dvouvláknovou deoxyribonukleovou kyselinou (DNA). V návaznosti na můj předchozí výzkum (vedený v rámci mé diplomové práce) byl prvním zkoumaným analytem 4-nitrobifenyl (4-NBP), který je podezřelý z karcinogenity. Interakce DNA se 4-NBP byla studována diferenční pulzní voltametrií (DPV), cyklickou voltametrií (CV) a chronocoulometrií na visící rtuťové kapkové elektrodě (HMDE), a dále s využitím CV a AC voltametrie (voltametrie se střídavým potenciálem) na DNA modifikované HMDE. Pomocí CV byl studován mechanismus redukce 4-NBP. Dále byla věnována pozornost studiu interakce DNA se 4-aminobifenylem (4-ABP), metabolitem 4-NBP, a s meziprodukty redukce 4-NBP. Bylo zjištěno, že vlivem interakce DNA se 4-NBP a 4-ABP dochází ke vzniku agregátů DNA s těmito analyty. Druhým studovaným analytem byla methylová violeť 2B (MV). Ke stanovení MV v pufrovaném roztoku byly použity DC tast polarografie a diferenční pulzní polarografie na kapající rtuťové elektrodě (DME) a DC voltametrie, DPV a diferenční pulzní adsorpční rozpouštěcí voltametrie (DPAdSV) na HMDE. Nejnižší mez stanovitelnosti (13 nmol L−1 ) byla...
|
host ::
RSS.