|
|
Studie s cílem odhalit nové zástupce hemových senzorových proteinů
Pašek, Dominik ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Dračínská, Helena (oponent)
Hemoproteiny jsou rozmanitou a velmi významnou skupinou proteinů podílející se na celé řadě biochemických pochodů. Mezi jejich typické role v živých organismech patří uskladňování a distribuce kyslíku, enzymová katalýza redoxních reakcí a transport elektronů v dýchacím řetězci. V relativně nedávné době byla objevena čtvrtá skupina hemoproteinů, tzv. hemové senzorové proteiny. Do této skupiny náleží mimo jiné proteiny, které disponují schopností reversibilně vázat hem, jenž takových případech plní funkci signální molekuly. Tato reversibilní interakce má pro buňky zásadní význam v některých signalizačních drahách. Jak bylo zjištěno, jedním z hemových senzorových proteinů je také významný transkripční faktor, protein p53. První fáze předkládané diplomové práce byla věnována přípravě proteinů rodiny p53 včetně některých jejich delečních mutantů. Následně bylo úkolem u vybraných proteinů prostudovat vliv hemu na jejich oligomerní stav. Zásadní část diplomové práce je tvořena spektrofotometrickými studiemi, které si kladly za cíl odhalit potenciální interakce studovaných proteinů s hemem, popřípadě dané interakce charakterizovat. Klíčová slova: hem, hemové senzorové proteiny, rodina proteinu p53, transkripční faktory, signální transdukce
|
|
|
Pozitivní a negativní aspekty ketózy na lidské zdraví
Kulhavá, Barbora ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Alán, Lukáš (oponent)
Tato bakalářská práce se zabývá problematikou ketózy a ketogenních diet. Práce popisuje proces vzniku ketolátek, věnuje se jeho regulaci a zaměřuje se také na proces utilizace těchto látek v periferních tkáních. Cílem práce bylo shrnout pozitivní přínosy ketózy v léčbě některých vážných onemocněních, její účinnost při redukci tělesné hmotnosti a její pozitivní přínosy v adaptaci lidského těla na hladovění. Práce se také zaměřuje na možný negativní vliv ketogenních diet na rozvinutí chronického onemocnění ledvin. Po zpracování zdrojů o problému negativ a pozitiv ketózy na lidský organismu se ukázalo, že pod odborným vedením ketogenní diety a s nimi spojená ketóza mají převažující pozitivní vliv na zdravý lidského organismu. KLÍČOVÁ SLOVA: Ketóza, ketogenní dieta, ketolátky, léčba rakoviny, dětská epilepsie, ketoacidóza
|
|
|
Phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2α by alternative phosphate sources catalyzed by heme-regulated kinase: kinetic analysis
Ovad, Tomáš ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Heidingsfeld, Olga (oponent)
diplomová práce Ing. Bc. Tomáš Ovad Fosforylace eukaryotického iniciačního faktoru 2α alternativními zdroji fosfátu katalyzovaná kinasou regulovanou hemem: kinetická analýza Tato diplomová práce je zaměřena na fosforylaci eukaryotického iniciačního faktoru 2α (eIF2α) inhibitorem regulovaným hemem (HRI), která je klíčovou reakcí v regulaci eukaroytické pro- teosyntézy. V předešlých studiích byly stanoveny kinetické parametry této reakce v přítomno- sti ATP jako donoru fosfátu. Nebyla však studována možnost využití alternativních NTP (GTP, UTP, CTP) jako zdrojů fosfátu pro tuto reakci. V této diplomové práci byl hetero- logní expresí v E. coli získán wild-type enzym HRI a byla studována jeho kinasová aktivita v přítomnosti ATP, GTP, UTP a CTP. Byly určeny kinetické parametry a střední inhibiční koncentrace hemu pro reakci katalyzovanou HRI v přítomnosti jednotlivých NTP jako zdrojů fosfátu. Pro validaci těchto kinetických experimentů byly vyloučeny kontaminace ATP v roz- tocích GTP, UTP a CTP pomocí iontově párové chromatografie. Ukázalo se, že ačkoli ATP je nejefektivnějším zdrojem fosfátu pro kinasovou aktivitu HRI, i zbývající NTP (GTP, UTP, CTP) mohou být v dané reakci využity jako donory fosfátu. Tato...
|
|
|
Dvousložkový signalizační systém bakterií využívající analogy hemu
Bečková, Alexandra ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Prošková, Veronika (oponent)
5 Abstrakt Hemoproteiny jsou esenciální součástí jak prokaryontních, tak eukaryotních organizmů, kde hrají roli při naplňování mnoha významných životních funkcí. Dle funkce je možné hemoproteiny rozdělit do několika typů. Konkrétní typ proteinů, který byl i objektem zájmu téhle bakalářské práce jsou senzorové hemoproteiny. Funkce části těchto senzorových hemoproteinů spočívá v schopnosti detekce diatomických molekul plynů a jejich následném navázaní na molekulu hemu v daném hemoproteinu, čímž se změní vlastnosti taky senzorového hemoproteinu a následně se signál stává součástí signalizačních drah. Příkladem senzorového hemoproteinu je histidinkinasa s globinovou strukturou senzorové domény z Anaeromyxobacter sp. Fw 109 (AfGcHK), s kterou se během experimentální části bakalářské práce pracovalo. Nejprve byla provedena transformace E. coli BL-21 (DE3) buněk plazmidem pET21c(+)/AfGcHK, následná kultivace buněk a exprese AfGcHK proteinu v buňkách. Exprimovaný AfGcHK protein byl izolován ve dvou formách. Jedna forma představovala AfGcHK protein s obsahem hemu, tedy se zabudovaným železem ve své struktuře. Druhá forma představovala AfGcHK protein s obsahem analogu hemu, který měl ve své struktuře místo železa zabudován nikl. Protein s obsahem hemu byl izolován s výtěžkem 3,98 mg/l TB média a protein s obsahem...
|
|
|
Hemové senzorové proteiny jako potenciální markery oxidačního a buněčného stresu indukovaného ionizujícím zářením
Vávra, Jakub ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Souček, Pavel (oponent) ; Tichý, Aleš (oponent)
Ionizující záření je jedním z možných induktorů oxidačního stresu v buňce. Důsledkem této patologické situace je vznik reaktivních radikálů, které mohou modifikovat klíčové biomolekuly. V závislosti na dávce způsobuje expozice organismu ionizujícímu záření deterministické (nemoc z ozáření) či stochastické (maligní procesy) účinky. Proto je v případě suspektní expozice organismu ionizujícímu záření nutno rychle a efektivně stanovit jeho dávku. Přesto nebyla dosud vyvinuta účinná, rychlá a zároveň rutinně aplikovatelná metoda pro stanovení dávky pomocí biologických markerů. Cílem předkládané disertační práce je proto prostřednictvím nových poznatků o hemových senzorových proteinech přispět k pochopení mechanismů, jimiž buňky reagují na oxidační stres. Předkládaná disertační práce se zaměřuje na dva eukaryotické proteiny, kinasu HRI (z anglického názvu "heme regulated inhibitor") a transkripční faktor p53. Důraz je kladen na modulaci funkcí a konformačního stavu těchto proteinů prostřednictvím molekuly hemu. Součástí disertační práce je také optimalizace metod klíčových pro splnění jejích hlavních cílů. Konkrétně byla pomocí elektroforézy v prostředí Phos-tagu studována kinasová aktivita přirozené formy HRI a mutantní formy Gly202Ser, jejíž výskyt je asociován s nádory plic. V případě obou forem byl...
|
|
|
Mechanismus přenosu signálu v modelovém zástupci prokaryotních hemových senzorů kyslíku
Smrčka, Tomáš ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Stráňava, Martin (oponent)
Dvou-komponentní systém, sestávající se z histidin kinasy a responzivního regulátoru, je nezbytnou molekulárně biologickou výbavou mnoha bakterií, pomocí níž je bakterie schopna reagovat na změny v prostředí. Důležitým krokem při aktivaci dvou- komponentního systému je autofosforylační reakce na dimerní histidin kinase, při které na tomto proteinu dochází k přenosu fosfátové skupiny z ATP v katalytické doméně na konzervovanou molekulu histidinu. Podle toho, zda dochází k přenosu fosfátové skupiny v rámci jedné podjednotky dimeru nebo z jedné podjednotky na druhou podjednotku rozlišujeme cis-, respektive trans-autofosforylaci. Předkládaná diplomová práce si ke studiu autofosforylační reakce zvolila histidin kinasu s globinovou doménou z půdní bakterie Anaeromyxobacter sp. Fw109-5 (AfGcHK), která využívá hemu k detekci plynných molekul. Užitím fosforylační analýzy heterodimeru AfGcHK složeného z podjednotky s defektním místem pro vazbu ATP a podjednotky se zaměněným fosforylovatelným histidinem za alanin byl pro AfGcHK identifikován trans- mechanismus autofosforylace. Klíčová slova: dvousložkové signální systémy, histidinkinasa, hemové senzory kyslíku, Phos-tag, AfGcHK
|
|
|
Detailní enzymová charakterizace modelového zástupce hemových kyslíkových senzorů
Vojáčková, Lukrécie Sophie ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Čermáková, Michaela (oponent)
Tato práce je zaměřena na hemové senzorové proteiny detekující kyslík, zejména na fosfodiesterasu z bakterie Escherichia coli, označovanou jako EcDOS. Tento enzym katalyzuje degradaci c-di-GMP, což je důležitá signální molekula bakterií, jež má vliv na určité buněčné pochody, např. na pohyblivost bakterií nebo tvorbu biofilmů. Práce se zabývá detailní enzymovou kinetikou forem proteinu v různých redoxních a ligandových stavech iontu železa hemu [Fe(III), Fe(II) a Fe(II)-O2] a věnuje se také mutantní formě tohoto enzymu (EcDOS H77A), která neváže hem. Jedním z výsledků práce bylo potvrzení toho, že forma EcDOS WT Fe(II)-O2 vykazuje vyšší hodnoty kcat než forma EcDOS s iontem železa hemu v redukovaném stavu. Překvapením bylo zjištění, že aktivita enzymu je ovlivněna nejen stavem iontu železa hemu, ale i přítomnými dvojmocnými kationty kovů a jejich koncentracemi. Přítomnost kationtu kovu je pro funkci enzymu esenciální a vhodnými ionty kovů, které stimulují enzymovou aktivitu, jsou Mg2+ , Mn2+ a Zn2+ nebo jejich směsi, jež působí na aktivitu enzymu za zvolených podmínek synergicky. Analýza pomocí ICP-MS také prokázala, že kationty Zn2+ jsou přirozenou součástí enzymu. Tudíž by pro další kinetické studie bylo vhodné využít Zn2+ nebo směsi iontů kovů, které jsou fyziologické pro E. coli, z níž EcDOS...
|
|
|
Studium struktury a funkce modelových hemových proteinů
Lengálová, Alžběta ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Hudeček, Jiří (oponent) ; Muchová, Lucie (oponent)
Hem je jedním z nejdůležitějších a nejlépe prostudovaných kofaktorů potřebných pro správné fungování mnoha proteinů. Proteiny obsahující hem tvoří obrovskou skupinu biologicky významných molekul, které se účastní mnoha fyziologických procesů. Předkládaná disertační práce se věnuje dvěma skupinám hemových senzorových proteinů, a to prokaryotickým hemovým senzorům plynných molekul a eukaryotickým senzorům detekujících hem. Hemové senzory, které detekují plynné molekuly, hrají důležitou roli v regulaci mnoha bakteriálních procesů a jsou obvykle tvořeny dvěma doménami, doménou senzorovou a doménou funkční. Disertační práce se zaměřuje na studium dvou zástupců ze skupiny bakteriálních senzorů detekujících plyny, histidinkinasy AfGcHK a diguanylátcyklasy YddV. Hlavním cílem práce bylo objasnit mechanismus mezidoménového přenosu signálu u těchto dvou modelových hemových senzorů. Za pomoci rentgenové krystalografie a metody vodík-deuteriové výměny v kombinaci s hmotnostní spektrometrií byly odhaleny významné rozdíly ve struktuře proteinu AfGcHK při přechodu z jeho aktivní na neaktivní formu. Příjem určitého signálu senzorovou doménou AfGcHK ovlivní strukturní vlastnosti proteinu, a tyto konformační změny mají pak nepřímo vliv na enzymovou aktivitu domény funkční. Disertační práce se dále detailněji věnuje...
|
|
|
Studium vlivu analogů hemu na strukturně-funkční charakteristiku modelového zástupce hemových senzorových proteinů
Ďatko, Peter ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Vávra, Jakub (oponent)
Hemové senzorové proteiny umožňují bakteriálním buňkám reagovat na změnu koncentrace látek v jejich okolí. Tato odpověď závisí na vazbě ligandu na atom železa, koordinovaného v molekule hemu. Modelem tohoto signálního systému je histidinkinasa s globinovou strukturou senzorové domény, AfGcHK. Hlavním cílem této bakalářské práce byla příprava a základní charakterizace formy AfGcHK, která místo hemu obsahuje komplex protoporfyrinu s manganem. Pro expresi proteinu byla využita transformace buněk E. coli BL- 21 (DE3) plamidem pET21c(+)/AfGcHK. Protein byl izolován a purifikován pomocí afinitní chromatografie a gelové chromatografie. Pro zjištění enzymové aktivity byla použita elektroforéza na polyakrylamidovém gelu v prostředí dodecylsíranu sodného s přídavkem Phos-tagu. Bylo zjištěno, že připravená unikátní forma AfGcHK je enzymově aktivní. Dále provedená spektrální analýza prokázala, že forma AfGcHK obsahující komplex protoporfyrinu s manganem je citlivá k redukci dithioničitanem sodným. Klíčová slova: hem, hemové senzorové proteiny, kyslíkový senzor, přenos signálu
|
|
|
Biochemická charakterizace modelového zástupce hemových senzorových proteinů obsahujícího analog hemu
Hlubučková, Darina ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Prošková, Veronika (oponent)
Nedílnou součástí života buněk je buněčná signalizace, která je zajištěna mimo jiné hemovými proteiny, konkrétně jejich skupinou s názvem hemové senzorové proteiny. Hemové senzorové proteiny se dělí do dvou skupin, hemové senzorové proteiny detekující hem, které se vyskytují spíše v eukaryotních buňkách a hemové senzorové proteiny detekující plynné molekuly, které jsou typické spíše pro prokaryotní buňky. Plynnými molekulami mohou být v tomto případě CO, NO a O2. Skupina hemových senzorových proteinů detekujících kyslík má kruciální význam pro bakterie, které se musí přizpůsobovat proměnlivé koncentraci kyslíku v okolním prostředí. Jednou z těchto bakterií je půdní bakterie Anaeromyxobacter sp., kmen Fw 109-5, která obsahuje hemový senzorový protein s globinovou strukturou senzorové domény a histidinkinasovou aktivitou domény funkční (AfGcHK), umožňující bakteriím kromě jiného například tvorbu biofilmu.. . V rámci teoretické části této práce byly shrnuty dosavadní poznatky o hemových senzorových proteinech se zaměřením na protein AfGcHK. V praktické části této bakalářské práce byly transformovány bakteriální buňky E. coli BL-21 (DE3) plazmidem pET21(+)/AfGcHK obsahujícím gen kódující AfGcHK, ze kterých byly následně izolovány dvě formy AfGcHK, přirozená forma a forma obsahující analog hemu,...
|
host ::
RSS.