|
|
Je tvorba hlíz řízena podobnými mechanismy jako kvetení?
Stupecká, Lenka ; Lipavská, Helena (vedoucí práce) ; Fischer, Lukáš (oponent)
Přechod z vegetativní do generativní fáze se u rostlin nazývá kvetení. Správné načasování kvetení je zásadní podmínkou pro úspěšnou reprodukci rostlin. Kvetení je ovlivněno mnoha vnějšími a vnitřními faktory, mezi které patří délka dne neboli fotoperioda. Fotoperioda je vnímána v listech, v nichž také vzniká mobilní signál "florigen", který je transportován z listů do stonkového apikálního meristému, kde iniciuje kvetení. Fotoperiodická regulační dráha zahrnuje geny, jejichž vzájemné působení společně s působením genů z dalších regulačních drah určí dobu, kdy bude rostlina kvést. Tuberizace bramboru je důležitý morfogenetický proces, při kterém se z podzemní části stonku - stolonu - vytvářejí zásobní orgány, hlízy. Správné načasování procesu, které je nutné pro úspěšné přezimování a vegetativní množení bramboru, je řízeno jak vnitřními podmínkami, tak i vnějšími podmínkami prostředí, především teplotou, dostupností živin a fotoperiodou. Z hlediska fotoperiody působí na zakládání hlíz stimulačně krátký den. Fotoperiodická dráha kontrolující proces tuberizace má několik prvků společných s fotoperiodickou dráhou kontrolující kvetení, včetně účasti mobilního signálu - "tuberigenu". Současné výsledky ukazují, že působení jednotlivých proteinů fotoperiodické regulační dráhy může být u kvetení a...
|
|
|
Modifikace chromatinu v souvislosti s "priming" fenoménem u rostlin
Marková, Hana ; Holá, Dana (vedoucí práce) ; Fischer, Lukáš (oponent)
Rostliny jsou v přirozeném prostředí vystaveny mnoha různým stresorům, kterým se musí dokázat přizpůsobit. Bylo zjištěno, že rostliny si mohou "zapamatovat" předchozí stresovou odpověď a na následné vystavení stejnému stresoru zareagovat rychleji a ve větší míře. Jedním z předpokládaných mechanismů tohoto tzv. "primingu" by mohly být změny na úrovni chromatinových modifikací. Modifikace chromatinu se zpravidla v průběhu stresové reakce dynamicky mění. Některé změny by však mohly zůstat trvalé, čímž by se vytvořila specifická, meioticky nebo mitoticky transmisibilní "stresová paměť". V případě mitoticky transmisibilní "stresové paměti" byl takový jev zatím pozorován u stresu v důsledku dehydratace, zasolení, mechanického poškození, kombinace různých stresorů a systémové rezistence na patogenní bakterie. Zatím se jedná jen o několik málo studií; už teď se ale ukazují rozdíly v reakci konkrétních genů, stejně jako závislost na délce stresového stimulu a délce period mezi prvním a druhým stresem. Velkým nedostatkem dosavadních studií je jejich zaměření pouze na histonové modifikace. Nicméně v rámci dosud studovaných chromatinových modifikací se zdá, že jako hlavní značka pro "priming" by mohla sloužit převážně H3K4me3. Naproti tomu modifikace H3K27me3 zřejmě jako "paměťová značka" neslouží. Na vyvození...
|
|
|
Specifické funkce podjednotek ARP2/3 komplexu
Fišerová, Kamila ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Oulehlová, Denisa (oponent)
Aktin je jedním z nejrozšířenějších proteinů v živých organismech. Regulaci aktinového cytoskeletu zajišťuje mnoho mechanismů, jedním z regulátorů dynamiky aktinu u rostlin i živočichů je vysoce konzervovaný - Arp2/3 komplex. U všech organismů je tvořen dvěma velkými podjednotkami (Arp2 a Arp3) a pěti malými podjednotkami (ArpC1- ArpC5). Arp2/3 komplex řídí větvení aktinových filament v úhlu 70o . V předložené práci jsou popsány funkce jednotlivých podjednotek se zvláštním důrazem na ty, které jsou pro jednotlivé podjednotky specifické. Vytvořený souhrn překračuje hranice rostlinné říše a věnuje se i živočichům a kvasinkám, u kterých je tento komplex aktivně zkoumán, a je dostupná řada informací o mechanismech jeho regulace. V práci jsou shrnuty vzájemné interakce mezi podjednotkami i jejich interakce s regulátory Arp2/3 komplexu a dalšími proteiny. Některé z podjednotek jsou u některých organismů kódovány i více než jedním genem, v takových případech mohou mít tyto izoformy i rozdílné funkce. Arp2/3 komplex je pro živočichy nezbytný k životu, u rostlin mají však mutace v podjednotkách tohoto komplexu mírnější projevy. V rostlinách se Arp2/3 komplex uplatňuje především v rychlém a orientovaném růstu, mutace podjednotek se proto projevují typickým poškozením trichomů. Klíčová slova - Arp2/3 komplex,...
|
|
|
Glutamin syntetázy a jejich role v metabolismu dusíku v prýtu rostlin
Kobercová, Eliška ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Tylová, Edita (oponent)
Glutamin syntetáza je klíčový enzym pro asimilaci amonných iontů a biosyntézu glutaminu v rostlinách. Amonné ionty jsou důležitým meziproduktem metabolismu dusíku, ve zvýšené koncentraci jsou však pro rostlinu toxické. Správné fungování glutamin syntetázy je pro rostlinu životně důležité - glufosinát, specifický inhibitor glutamin syntetázy, účinkuje jako totální herbicid. Glutamin syntetáza se uplatňuje v řadě významných metabolických procesů: při primární asimilaci dusíkatých živin, při reasimilaci amonných iontů během fotorespirace či metabolismu fenylpropanoidů a při remobilizaci dusíku při tvorbě semen, během klíčení nebo senescence. Podle lokalizace v buňce se glutamin syntetázy krytosemenných rostlin dělí na plastidovou (GS2), která je kódována zpravidla jedním genem, a na cytosolickou (GS1), kterou kóduje rodina několika genů. Jednotlivé isoformy glutamin syntetáz mají rozdílnou lokalizaci v rámci rostlinných orgánů a pletiv, liší se způsobem regulace a úlohou v metabolismu dusíku. Klíčová slova: plastidová a cytosolická glutamin syntetáza, asimilace amonných iontů, metabolismus dusíku, fotorespirace
|
|
|
Izolace a charakterizace genu pro lakázu u ječmene (Hordeum vulgare L.)
Drábková, Lenka ; Kučera, Ladislav (vedoucí práce) ; Čurn, Vladimír (oponent) ; Fischer, Lukáš (oponent)
Lakázy jsou jedněmi z prvních studovaných enzymů. Poprvé se o lakáze zmínil Yoshida ve své publikaci v roce 1883 (Yoshida H, 1883). Lakázy (EC 1.10.3.2, p-difenol-O2 oxidoreduktáza), mezi které lze i zařadit LMCO, jsou enzymy obsahující měď a jsou součástí větší skupiny enzymů nazývané polyfenoloxidázy. Lakázy katalyzují oxidaci širokého spektra substrátů, např. polyfenoly, substituované fenoly, diaminy, ale i některé anorganické sloučeniny za současné redukce kyslíku na vodu. Zdrojem elektronů v těchto redoxních reakcích jsou u těchto enzymů obvykle čtyři atomy mědi. Lakázy hub, které jsou dosud nejvíce studovanou skupinou, jsou známé pro svoji roli v odbourávání ligninu, bioremediaci, morfogenezi a patogenitě. Navzdory mnoha letům výzkumu, fyziologické funkce lakáz v rostlinách zůstávají velkou neznámou. Předpokládá se, že rozhodující úlohu hrají lakázy u rostlin při lignifikaci. Podílí se hlavně na syntéze ligninu, udržení integrity buněčné stěny a její struktury a na hojení ran. Lakázy mohou katalyzovat širokou škálu enzymatických reakcí a mají patrně svou úlohu v rámci reakce rostlin na stres. Lakázy rostlin byly popsány zejména u huseníčku rolního (Arabidopsis thaliana), u kukuřice (Zea mays) a u rýže seté (Oryza sativa). U dalších hospodářsky významných rostlin nebyla lakáza zatím...
|
|
|
Metylace DNA řízená malými RNA u Arabidopsis thaliana
Motylová, Šárka ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Moravec, Tomáš (oponent)
Rozdílná transkripční aktivita různých oblastí genomu je zajišťována epigenetickými modifikacemi, mezi které patří metylace DNA, úprava N-koncových aminokyselin histonů a změny v zastoupení histonových variant. RNA interference je regulační proces, při kterém dochází prostřednictvím malých RNA odvozených z exogenních či endogenních sekvencí k posttrankripčnímu nebo transkripčnímu umlčení těchto sekvencí. 24-nukleotidové siRNA, tvořící část malých RNA, řídí de novo metylaci a spoluúčastní se udržování metylace DNA (RNA-directed DNA methylation; RdDM), která se podílí na transkripčním umlčení heterochromatinu a transponovatelných elementů, vyskytujících se u rostlin ve velkém množství. Pro krytosemenné je také charakteristická přítomnost RNA polymeráz IV a V účastnících se v této dráze, které byly poprvé objeveny v genomu Arabidopsis thaliana, jež se stala hlavní modelovou rostlinou i pro studium RdDM. Polymeráza IV přepisuje prekurzory siRNA; siRNA jsou následně asociované s AGO4 proteiny a navádějí metylační enzymy na cílové sekvence prostřednictvím komplementarity s transkripty polymerázy V.
|
|
|
Transformace lilku bramboru genem kódujícím proteázový inhibitor SPI-2
Říhová, Barbora ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Vítámvás, Pavel (oponent)
Předmětem této diplomové práce byla genetická modifikace lilku bramboru za účelem zvýšení jeho rezistence vůči patogenům a škůdcům. Při vývoji rezistence rostlin se často využívá podobných typů molekul, které rostliny samy využívají při svých obranných reakcích. V této práci byl pro genetickou modifikaci použit gen kódující zástupce inhibitorů serinových proteáz SPI-2, pocházející ze zavíječe voskového (Galleria mellonella). Jelikož se v předchozích pokusech týmu protein SPI-2 nepodařilo v transformovaných rostlinách detekovat, byla základní forma genu upravena přidáním Kozakové sekvence do okolí iniciačního kodónu, čímž se měla zvýšit iniciace translace a tím hladina proteinu. Pro transformaci byly připraveny dva konstrukty, kódující proteiny SPI-2-T a SPI-2-Y, které se liší jednou aminokyselinou, a to mírně pozměňuje jejich inhibiční aktivitu. Konstrukt SPI-2-T byl nejprve pomocí infiltrace s Agrobacterium tumefaciens vnesen do listů tabáku Nicotiana benthamiana. Oba konstrukty SPI-2-T a SPI-2-Y byly poté použity pro stabilní transformaci lilku bramboru (Solanum tuberosum cv. Desireé). Přítomnost proteinu se však v rostlinách nepodařilo prokázat, přestože byl vnesený gen transkribován a jeho sekvence v rostlinách byla ověřena sekvenací. Je tedy pravděpodobné, že protein není v cytoplazmě...
|
|
|
Na velikosti záleží - biogeneze a funkce siRNA u Arabidopsis
Přibylová, Adéla ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Honys, David (oponent)
RNA interference (RNAi) hraje důležitou roli v různých biologických procesech zahrnujících regulaci genů a transposonů, vývoje částí rostlinného těla, reakci na stres, remodelaci chromatinu a antivirovou obranu. Základem RNAi jsou krátké molekuly RNA (malé RNA, sRNA), které rostliny produkují ve velikostním rozmezí 21 - 24 nukleotidů (nt) a které jsou schopny na základě komplementarity rozpoznat cílové molekuly RNAi. Malé RNA lze rozdělit na dva základní typy: microRNA (miRNA) a malé interferující RNA (siRNA). K tvorbě a aktivitě malých RNA jsou potřeba proteiny z několika genových rodin: DICER-LIKE (DCL) vytváří malé RNA z dvouvláknového RNA prekurzoru, který je často tvořen aktivitou RNA dependentní RNA polymerázy (RDR). Proteiny ARGONAUTE (AGO) s těmito malými RNA asociují a vytváří tak RNA-indukovaný umlčující komplex (RISC), který hraje klíčovou roli v rozpoznání cílové molekuly a ve výkonné fázi RNAi. Na to, jakou dráhou se bude RISC komplex ubírat, má vliv velikost, struktura i biogeneze malé RNA. RNAi působí jednak na post-transkripční úrovni (PTGS), formou degradace cílové RNA či blokováním translace, a jednak na transkripční úrovni (TGS), kde sRNA zprostředkovávají metylaci histonů a DNA.
|
|
|
Umlčování exprese transgenů v rostlinách bramboru a v buněčné linii tabáku BY-2
Tyč, Dimitrij ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Honys, David (oponent)
Náhodný objev RNA interference před pár desítkami let u rostlin a její následné popsání Firem et al. v roce 1998 znamenal doslova revoluci v molekulární biologii a řadě dalších oborů. Výzkumníci odkryli rozsáhlý a nečekaný mechanizmus regulace genové exprese na mnoha úrovních u téměř všech studovaných eukaryot. Prvotní studie u rostlin odhalily umlčování exprese z vnějšku dodaných genů i příslušných endogenů. Brzy bylo tedy jasné, že tento proces neslouží organizmům pouze v obraně před viry, ale i před mobilními genetickými elementy a k regulaci vlastních genů. Společným jmenovatelem všech mechanizmů RNAi je dvouvláknová RNA, která je štěpena na malé RNA. Ty pak řídí v součinnosti s řadou dalších proteinů buď štěpení částečně či plně komplementární mRNA či blokují její translaci v procesu posttranskripčního umlčování (PTGS), nebo se v procesu RNA řízené metylace DNA (RdDM) podílejí na umlčování genů na transkripční úrovni doprovázené remodelací chromatinu. Mechanizmy RNAi se uplatňují i při transformaci rostlin, kdy způsobují v odvozených liniích značnou variabilitu a nestabilitu v expresi vnesených genů. Řada biotechnologických postupů ovšem vyžaduje dlouhodobou definovanou a stabilní expresi transgenu, kterou právě RNAi znesnadňuje. Hlavním cílem diplomové práce bylo posoudit vliv vybraných...
|
|
|
Proteomická a funkční charakterizace izoforem PsbO
Duchoslav, Miloš ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Hála, Michal (oponent)
PsbO (mangan-stabilizující protein) je jedním z vnějších proteinů fotosystému II vázaných z luminální strany. Nachází se ve všech oxyfototrofních organismech a zajišťuje správnou funkci Mn4CaO5 klastru, kde probíhá fotosyntetický rozklad vody. Tato práce je zaměřena především na PsbO vyšších rostlin a jeho izoformy - jejich evoluci a funkce. Bioinformatickými analýzami jsme zjistili, že většina vyšších rostlin exprimuje právě dvě izoformy psbO. Fylogenetický strom vytvořený ze sekvencí PsbO má neobvyklou topologii. Na jednotlivé vzájemně paralogní izoformy se neštěpí u báze, jak by se dalo očekávat, ale spíše až na koncích jednotlivých větví, na úrovni čeledí či ještě nižších taxonomických jednotek. V práci jsme navrhli a diskutovali několik hypotéz evoluce izoforem PsbO. Součástí práce byla detailní identifikace spotů na gelech z 2D IEF-SDS PAGE tylakoidů bramboru, ve kterých se vyskytuje PsbO. Ve většině spotů jsme identifikovali konkrétní variantu izoformy. Nepodařilo se nám nalézt žádné posttranslační modifikace PsbO. Optimalizovali jsme metodu exprese psbO špenátu v E. coli a následné purifikace, která umožňuje získat velké množství správně sbaleného rekombinantního proteinu. Pomocí CD spektrometrie jsme zjistili, že při změnách pH typických pro lumen tylakoidů při změně osvětlení se mírně mění...
|
host ::
RSS.