|
|
Molecular details of translation reinitiation in budding yeast
Mohammad, Mahabub Pasha ; Valášek, Leoš (vedoucí práce) ; Mašek, Tomáš (oponent) ; Krásný, Libor (oponent)
Eukaryotická iniciace translace je vysoce komplexní proces zahrnující celou řadu fází. Iniciace translace je zahájena sestavením preiniciačního komplexu 43S, který nasedá na 5' čepičku mRNA a následně pročítá mRNA za účelem rozpoznání vhodného AUG start kodónu. Po rozeznání AUG kodónu většina iniciačních faktorů z komplexu 48S disociuje. Některé z těchto faktorů nicméně zůstávají s komplexem 48S přechodně asociované, jedná se například o eIF3 a nejspíše o eIF4G. V rámci této práce jsme vyvinuli metodu RNA-protein Ni2+ -pull down (Rap-Nip), která slouží k in vivo detekci fragmentů mRNA navázaných na eIF3 v kvasinkách. Ukázali jsme, že eIF3 kvasinky Saccharomyces cerevisiae zůstává po iniciaci translace perzistentně navázán na elongujících ribozomech po dobu několika elongačních cyklů. eIF3 navíc stabilizuje post-terminační komplex 40S na stop kodónu krátkých čtecích rámců uORF1 a uORF2 GCN4 a to prostřednictvím kontaktu mezi N-terminální částí podjednotky a/TIF32 a elementy podporujícími reiniciaci (RPEs) příslušného uORF GCN4. S využitím β-galaktosidázového reportérového systému jsme odhalili, že AU- bohatý motiv (motiv AU1-2A/ UUAU2) nacházející se těsně za stop kodonem reiniciačně (REI)-permisivních uORFs podporuje autonomně a místně specificky reiniciaci. Rovněž jsme ukázali, že přesná délka...
|
|
|
Factors interacting with bacterial RNA polymerase and their effect on the regulation of transcription initiation
Ramaniuk, Volha ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent) ; Valášek, Leoš (oponent)
(ČESKÝ) Bakteriální buňka reguluje svou genovou expresi jako odpověď na změny růstových podmínek. RNA polymeráza (RNAP) je stěžejním enzymem pro tento proces, její aktivita je ovlivňována mnoha transkripčními faktory. Ve své práci se zabývám faktory, které se účastní regulace transkripce u grampozitivních baktérií: faktory σ, iniciačními nukleozid trifosfáty (iNTP), HelD, δ a malou RNA Ms1. Hlavní důraz v této práci je kladen na faktory σ z Bacillus subtilis. Faktory σ rozpoznávají specifickou sekvenci DNA promotoru a umožnují navázaní RNAP na tuto sekvenci. Ve svém prvním projektu jsem vytvořila transkripční systém in vitro s purifikovanými alternativními σ faktory z B. subtilis - σB , σD , σH , σI . Pomocí tohoto systému jsem zkoumala efekt změny koncentrace iNTP ([iNTP]) na iniciaci transkripce. Prokázala jsem, že promotory přepisované pomocí alternativních σ faktorů jsou často regulovány [iNTP]. V dalším projektu jsem charakterizovala jeden z nejméně prozkoumaných alternativních faktorů z B. subtilis, I . Identifikovala jsem ~130 genů ovlivněných I , přitom 16 z nich bylo přepisováno přímoI . Prokázala jsem, že se I účastní metabolizmu železa v buňce, a že se váže nejenom na klasické sekvence -35 a -10, ale také na "prodloužené" -35 a -10 elementy. Ve spolupráci s bioinformatickou...
|
|
| |
|
|
Molecular principles of translation reinitiation in mammals
Hronová, Vladislava ; Valášek, Leoš (vedoucí práce) ; Krásný, Libor (oponent) ; Staněk, David (oponent)
Iniciace translace představuje mnohastupňový proces, který zajišťuje sestavení 80S ribosomu na AUG start kodonu molekuly mRNA, jež má být přeložena do polypeptidového řetězce. Správný průběh tohoto procesu je řízen mnoha eukaryotickými iniciačními faktory (eIFs), z nichž nejdůležitějším je eukaryotický iniciační faktor 3 (eIF3). Hlavním cílem naší laboratoře je co nejpodrobněji popsat proteinový komplex eIF3 a také způsoby, jakými tento faktor přispívá k jednotlivým krokům procesu iniciace translace. Kromě toho též zkoumáme jeden z genově specifických kontrolních mechanismů translace zvaný reiniciace, který je, alespoň u kvasinek, umožňován právě faktorem eIF3. V této práci popisuji, že N-terminální doména (NTD) jedné z největších podjednotek kvasinkového eIF3, označované jako a/Tif32, hraje důležitou úlohu nejen ve vazbě eIF3 k 40S ribozomální podjednotce, ale taktéž významně přispívá k nasedání mRNA na 43S preiniciační komplexy in vivo. Stabilizační role N-terminální domény podjednotky a/Tif32 byla ověřena též v naší následující studii, a to biofyzikálními experimenty. Pomocí dalších in vivo přístupů jsme v této práci též dokázali, že pro mRNA s delšími 5'nepřekládanými oblastmi je stabilizační role a/Tif32-NTD důležitější než pro mRNA s krátkými 5'nepřekládanými oblastmi. V následujících...
|
|
| |
|
|
A study of the HCV IRES variability: An experimental approach coupled with design of a large-scale mutation database
Khawaja, Anas Ahmad ; Pospíšek, Martin (vedoucí práce) ; Hirsch, Ivan (oponent) ; Valášek, Leoš (oponent)
Iniciace translace u viru hepatitidy C (HCV) probíhá mechanismem nezávislým na čepičce, který využívá vnitřního vazebného místo pro ribozom (IRES), které interaguje s eukaryotním translačním aparátem a je schopné jej využívat. V našem výzkumu jsme se zaměřili na strukturní konformaci jednotlivých domén HCV-IRES a na dopad primární sekvence IRES na konzervovanost a funkci této sekundární struktury. Za tímto účelem byl proveden screening pacientů infikovaných virem hepatitidy C pro zjištění míry heterogenity a celkové variability HCV-IRES vzniklé u pacientů v průběhu jejich nemoci pomocí optimalizování metod, jako jsou gelové elektroforézy s denaturačním nebo teplotním gradientem. Účinnost translace mutovaných HCV-IRES sekvencí byla měřena pomocí průtokové cytometrie. V některých případech jsme zjistili, že několikanásobné mutace, včetně těch, které jsou rozesety mezi různé domény HCV-IRES, vedly k obnově translační aktivity, ačkoli tyto mutace účinnost translace snižovaly, pokud byly analyzovány jednotlivě. Navrhujeme, že tato pozorování by mohla být vysvětlena potenciálními mezi- a/nebo vnitro-doménovými funkčními interakcemi působícími na velkou vzdálenost. Také jsme nalezli nové mutace, jejichž vliv na účinnost translace HCV-IRES byl experimentálně ověřen. Vytvoření rozsáhlé databáze variací...
|
|
|
Functional analysis of eIF3e subunit of human translation initiation factor 3 in living cells.
Šikrová, Darina ; Valášek, Leoš (vedoucí práce) ; Šanderová, Hana (oponent)
3 Abstrakt Eukaryotický iniciační faktor 3 (eIF3) je významným hráčem zúčastňujícim se více kroků iniciace translace, která v konečném důsledku vede k vytvoření elongace-schopného 80S ribosómu. Se svými 13 podjednotkami (eIF3a - eIF3m) představuje najvětší a nejkomplexnější translační iniciační factor, který se skládá ze tří vzájemně popřepájených modulů (i - iii). Navzdory jeho bezesporné důležitosti, přínos jednotlivých podjednotek pro jeho struktúrní integritu a správnou funkci není plně proskúmaný. Bylo zjistěné, že eIF3e podjednotka je součásti oktamerního jadra lidského eIF3 komplexu a navyše bylo proukázané, že je komponentem molekulárního přemostění mezi 40S ribosomální podjednotkou a čepička- vazebným komplexem, čím tak napomáha vazbě mRNA na 43S preiniciační komplex. V této práci byl analyzovaný dopad siRNA navozenej zníženej exprese eIF3e podjednotky na integritu a funkci eIF3 v in vivo podmínkach. Znížení tvorby eIF3e, tzv. eIF3e knock-down (eIF3eK.D. ), vedlo k výraznýmu úbytku dalších 3 podjednotek (d, k a l), které spolu s podjednotkami c a e tvoří modul ii lidského eIF3 komplexu. Zvyšné moduly i (obsahujíci a, b, g a i) a iii (pozostávajíci z f, h a m) ostali sčásti spolu asociované pravděpodobně za pomoci eIF3c a ich vazebná afinita voči 40S podjednotce klesla. Navyše buňky s nedostatkem...
|
|
|
The role of translation initiation factor 3 (eIF3) in translation termination.
Beznosková, Petra ; Valášek, Leoš (vedoucí práce) ; Krásný, Libor (oponent) ; Staněk, David (oponent)
Syntéza proteinů v buňce je velmi regulovaný proces během genové exprese. Každý gen má svůj vlastní začátek a též jeden konec, který je určován přítomností jednoho ze tří stop kodónů. Mnoho součastných článků popisuje ribosomy, které záměrně přechází přes stop signál u některých vybraných mRNA, aby prodloužily vznikající polypeptid a změnily jeho vlastnosti. Tento regulační proces se nazývá programované pročítání stop kodónu. Výzkum této regulace má potenciál se uplatnit i v lékařství, neboť přibližně 15% všech dědičných chorob je způsobeno přítomností takzvaného předčasného terminačního kodónu (PTC), který zastaví translaci a vznikne tak zkrácený nefunkční protein. Mnohé laboratoře již hledají netoxické látky, které by zvyšovaly pročítání předčasného terminačního kodónu. Bohužel k úspěšnému naplnění jejich záměru je třeba identifikovat a porozumět všem faktorům, které tento process ovlivňují. V této disertační práci představujeme jeden takový faktor- eukaryotický iniciační faktor 3 (eIF3). Demonstrujeme jeho schopnost indukovat pročítání terminačních kodónů, které jsou v kontextu nukleotidů nevhodných pro efektivní terminaci. Taktéž jsme vytvořili analýzu "nearcognate" tRNA a ukázali, jak jsou inkorporovány na stop kodón, za kterým následují různé nukleotidy. Díky tomu jsme byli schopni rozšířit...
|
|
|
RNA polymerase: The "meeting point" of regulatory networks
Wiedermannová, Jana ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Pospíšek, Martin (oponent) ; Valášek, Leoš (oponent)
Bakteriální RNA polymeráza (RNAP) je proteinový komplex nepostradatelný pro přepis DNA do RNA. Jakožto klíčový enzym zodpovědný za regulaci genové exprese shromažďuje signály z buňky a reaguje na ně přesným nastavením úrovně transkripce jednotlivých genů. Tento proces ovlivňují jak vlastní podjednotky RNAP tak i další transkripční faktory (TF), které přímo nebo nepřímo interagují s RNAP. Cílem této disertace bylo prohloubit znalosti o komplexitě transkripční regulační sítě a o provázanosti jejích jednotlivých nitek, které jsou stále objevovány. Hlavním tématem této PhD práce je protein HelD, nově objevený vazebný partner RNAP z bakterie Bacillus subtilis. Ukázali jsme, že HelD se váže mezi sekundární kanál RNA polymerázy a alfa podjednotky tohoto enzymu. HelD se váže na RNAP ve formě jádra (bez přítomnosti sigma faktoru). Dokázali jsme, že HelD stimuluje transkripci v závislosti na ATP tím, že napomáhá jejímu cyklování a elongaci. Stimulační efekt proteinu HelD je násoben působením podjednotky delta, malé podjednotky RNA polymerázy specifické pro gram positivní (G+) bakterie. Tento fakt odhalil nové vztahy v provázanosti komplikované transkripční sítě. Další dvě publikace této práce pojednávají o vlastní delta podjednotce. Pomocí nukleární magnetické rezonance (NMR) jsme vyřešili 3D strukturu a...
|
|
|
Characterization of the molecular mechanism of translation reinitiation in yeast.
Pondělíčková, Vanda ; Valášek, Leoš (vedoucí práce) ; Hašek, Jiří (oponent) ; Vopálenský, Václav (oponent)
Iniciace translace je několika stupňový proces končící sestavením 80S ribozomu umožňujícího elongaci. Při tomto procesu se musí bezchybně složit velká a malá podjednotka ribozomu, mRNA, iniciační Met-tRNAi Met a nejméně 12 eukaryotických iniciačních faktorů (eIF). Tato fáze výroby proteinů je také klíčovým místem pro regulaci genové exprese. Naše laboratoř se zaměřuje zejména na iniciační faktor eIF3, který je tvořen více proteiny a uplatňuje se ve většině fází iniciace translace. Odhalili jsme a popsali roli eIF3 v reiniciaci, genově specifickém mechanismu kontroly translace, uplatňujícím se i v regulaci exprese důležitého kvasinkového transkripčního faktoru GCN4. V této práci přináším detailní studii N-terminální domény proteinu Tif32 (podjednotka eIF3a), která umožňuje několik funkcí. Předně ukazujeme, že Tif32-NTD funkčně interaguje s 5' sekvencí krátkého předcházejícího ORF (uORF1) v GCN4 mRNA a umožňuje tak následnou účinnou reiniciaci. V 5' sekvenci uORF1 byly identifikovány čtyři elementy podporující reiniciaci (REI-promoting elements, RPEs) a dva z nich působí v součinnosti s Tif32-NTD. Struktura 5' oblasti byla počítačově modelována a následně experimentálně potvrzena. Společný strukturní motiv byl nalezen i v 5' sekvenci dalšího kvasinkového genu YAP1, který rovněž obsahuje uORF...
|
host ::
RSS.