|
|
Funkce ABCF proteinů u bakterií
Mičke, Bianka ; Balíková Novotná, Gabriela (vedoucí práce) ; Lišková, Petra (oponent)
Translace je jedním z nejzákladnějších procesů odehrávajících se v živých buňkách. Jedná se přepis nukleotidové sekvence mRNA do proteinu, který probíhá na ribozomech. Během evoluce si organismy vyvinuly nepřeberné množství mechanizmů, kterými dokáží flexibilně reagovat na své potřeby. Jedním z těchto mechanizmů jsou i ABCF proteiny, které náleží do superrodiny ABC transportérů, ale na rozdíl od nich jim chybí transmembránová doména a neúčastní se transportních procesů. V buňkách se ABCF proteiny nacházejí volně v cytosolu nebo interagují s ribozomy. Dnes rozlišujeme dvě skupiny ABCF proteinů: antibioticko-rezistenční a proteiny, které regulují translaci. Ovšem tato funkce byla s jistotou potvrzena pouze u proteinu Etta. Antibioticko-rezistenční ABCF proteiny (ARE) se vážou na ribozom a ochraňují ho před působením antibiotik navazujících se na 50S ribozomální podjednotku. Regulační ABCF proteiny reagují na vnitřní a vnější buněčné podmínky. V případě neobvyklých podmínek se navazují na ribozomy a jsou stěžejní pro jejich správnou funkci. Dnes je známo 45 podrodin ABCF proteinů, ale struktura a přesný mechanizmus působení těchto proteinů je stále zahalen tajemstvím. Ve své práci shrnuji dostupné informace o bakteriálních ABCF proteinech. Klíčová slova: ABCF proteiny, antibiotická rezistence, ARE,...
|
|
|
Funkce šaperonu ClpX u bakterií
Kýr, Jan ; Balíková Novotná, Gabriela (vedoucí práce) ; Šiková, Michaela (oponent)
Intracelulární proteolýza je základní regulační proces ovlivňující buněčnou fyziologii. Jelikož proteolýza nevratně ničí proteiny, je nutné, aby byl tento proces přísně kontrolován. U bakterií jsou základními kameny regulované proteolýzy AAA+ proteiny. Tyto proteiny se skládají ze dvou funkčních domén a to AAA+ šaperonové domény a proteázové domény. Jednou skupinou těchto AAA+ proteinů je rodina Clp proteinů, u které jsou funkční domény tvořeny samostatnými proteiny. Jedním z těchto proteinům je hexamerická AAA+ unfoldáza ClpX. Tato unfoldáza může interagovat s vysoce konzervovanou proteázou ClpP za tvorby proteolytického komplexu ClpXP. Tento proteolytický komplex využívá energii vazby ATP a jeho hydrolýzu k rozbalení a translokaci specificky značeného substrátu do degradační komory ClpP. Rozpoznání substrátu je zprostředkováno vazbou ClpX na krátké nestrukturované sekvence nazývané degradační značky. ClpX rozpoznává velké množství degradačních značek, avšak nejzásadnější je rozpoznání ssrA degradační značky, která je výstupem tmRNA systému záchrany ribozomu. I když ClpX ve spojení ClpP ovlivňují celou řadu buněčných pochodů, jako je exprese virulentních faktorů či adaptace na stresové faktory, ClpX zastává i role zcela nezávislé na ClpP. Mezi takové role patří například regulace exprese proteinu...
|
|
|
Řízení genové exprese pomocí cis-působících nekódujících RNA a jejich význam při regulaci genů udílejících rezistenci k antibiotikům
Novotná, Michaela ; Balíková Novotná, Gabriela (vedoucí práce) ; Pospíšil, Jiří (oponent)
Práce je zaměřená na regulaci genové exprese zprostředkovanou vnitřními regulačními RNA elementy, které jsou součástí 5' koncové nepřekládané oblasti mRNA. Tyto tzv. r5'UTR elementy jsou schopné vázat velké množství typově odlišných molekul, od iontů a malých metabolitů přes transferové RNA až po velké proteinové komplexy. Na základě této interakce pak řídí projev downstream lokalizovaného genu, jehož exprese se tak stává inducibilní. Tento typ riboregulace je u bakterií široce využíván a uplatňuje se i v kontrole mnoha genů udílejících rezistenci k antibiotikům. Právě modulace takových genů je pro buňku značně výhodná, neboť zajišťuje omezení negativního vlivu na fitness bakterie, se kterým je exprese rezistenčních genů často spojena. Cílem práce je na molekulární úrovni charakterizovat všechny typy vnitřních regulačních elementů a nastínit, jak by mohly být znalosti o těchto systémech využity v klinické praxi při léčbě infekcí vyvolaných bakteriemi rezistentními k antibiotikům. Klíčová slova Regulace genové exprese, ncRNA, cis-působící regulační RNA, r5'UTR element, atenuace, antibiotická resistence
|
|
|
Charakterizace ABC-F proteinu Sco0636 u Streptomyces coelicolor
Pinďáková, Nikola ; Balíková Novotná, Gabriela (vedoucí práce) ; Mikušová, Gabriela (oponent)
Hlavním tématem této diplomové práce jsou ARE (rezistenční) proteiny z ABC-F rodiny druhé třídy ABC proteinů. ARE proteiny udílí rezistenci k antibiotikům, které se váží na velkou ribozomální podjednotku a inhibují tak proteosyntézu. Jedním z ARE proteinů je protein Lmr(C), který je součástí klastru pro biosyntézu linkomycinu u Streptomyces lincolnensis a dle nových výsledků se zdá, že Lmr(C) nemusí být striktně rezistenčním proteinem, ale může mít regulační funkci. Rozhodli jsme se pro studium Sco0636 nejbližšího homologu Lmr(C) u Streptomyces coelicolor, která je modelovým organismem při studiu sekundárního metabolismu. Díky produkci barevných pigmentů, lze sledovat vliv ARE proteinů na sekundární metabolismus přímo na plotnách. Připravila jsem deleční mutantu a kmen s konstitutivní expresí sco0636 a sledovala jsem vliv na fenotyp. Sledovala jsem produkce modrého aktinorodinu a stanovila jsem minimální inhibiční koncentrace k vybraným antibiotikům, které působí na úrovni ribozomu. Zjistila jsem, že Sco0636 udílí vysokou rezistenci k tiamulinu, a byl tak pojmenován jako TiaA. Delece genu zrychlila produkci aktinorodinu a konstitutivní exprese genu naopak produkci zpomalila. Klíčová slova: ABC proteiny, ABC-F proteiny, Lmr(C), translace, rezistence k antibiotikům, Streptomyces coelicolor, aktinorodin
|
|
|
Subcellular localization of resistant proteins Vga(A)LC and Msr(A) using fluorescence microscopy
Nguyen Thi Ngoc, Bich ; Balíková Novotná, Gabriela (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent)
Vga(A)LC a Msr(A) jsou klinicky významnými rezistentními proteiny u stafylokoků, které udělují rezistenci k inhibitorům translace. Patří mezi ARE ABC-F podrodinu proteinů, která je součástí ABC transportérů. Narozdíl od typických ABC transportérů, ABC-F proteiny nemají transmembránové domény, které jsou zodpovědné za transport látek přes membránu. Proto pro ně není charakteristická transportní funkce, ale regulační nebo rezistenční funkce. Jejich mechanismus působení na ribozomu byl popsán teprve nedávno, kde tyto proteiny vytěsňují antibiotikum z ribozomu. Stále jsou však některé aspekty jejich funkce neobjasněné. Například to, jaký je význam umístění Vga(A) na membráně, které bylo detekováno v membránové frakci nikoliv v ribozomální. V této práci jsem prostřednictvím fluorescenční mikroskopie pozorovala subcelulární lokalizaci rezistenčních fúzních proteinů Vga(A)LC-mEos2, Vga(A)LC- GFP a Msr(A)- eqFP650 v živých buňkách S. aureus, za různých kultivačních podmínek. Ukázalo se, že Vga(A)LC- GFP i Msr(A)- eqFP650 se vyskytují v ohnisku blízko membrány. V závislosti na ATPázové aktivitě nebo přítomnosti antibiotika se lokalizace Msr(A)- eqFP650 v buňce mění z ohniskové na difuzní, pravděpodobně na ribozomech, což navrhuje hypotézu o duálním mechanismu ARE ABC-F proteinů. Druhým cílem práce bylo...
|
|
|
Vznik a genetická podstata glykopeptidové rezistence u koaguláza-negativních stafylokoků
Prášilová, Jana ; Balíková Novotná, Gabriela (vedoucí práce) ; Lišková, Petra (oponent)
Glykopeptidová antibiotika jsou tzv. antibiotika poslední volby, v klinické praxi využívaná k léčbě těžších, převážně nozokomiálních infekcí vyvolaných multirezistentními koaguláza-negativními stafylokoky. Vznik a genetická podstata rezistence ke glykopeptidovým antibiotikům nebyla u koaguláza-negativních stafylokoků doposud objasněna. Výzkumy prováděné u Staphylococcus aureus prokázaly, že střední rezistence ke glykopeptidovým antibiotikům je spojena s přítomností jedné či více mutací, spíše než by byla podmíněna nosičstvím konkrétního genetického elementu, jako je tomu u enterokoků. Různými druhy selekce rezistentních mutant in vitro byly získávány izogenní páry glykopeptid citlivých a rezistentních kmenů Staphylococcus epidermidis a Staphylococcus haemolyticus. Analýzou sekvencí genomů těchto dvojic byly následně identifikovány jedno nukleotidové polymorfismy, které se nacházely převážně v systémech řídících metabolismus a regulaci buněčné stěny. Fenotypová analýza neodhalila přímé spojení glykopeptidové rezistence se zvýšenou tvorbou biofilmu. V klinické praxi je problematický vznik zkřížené rezistence glykopeptidových a jiných antibiotik. U neglykopeptidových antibiotik imipenemu a rifampicinu byl již dříve popsán výskyt zkřížené rezistence s glykopeptidovými antibiotiky u S. aureus. Selekcí...
|
|
|
Vliv exprese genu lmr(C) na biosyntézu linkomycinu u Streptomyces lincolnesis: Rezistence nebo produkce?
Veselá, Ludmila ; Balíková Novotná, Gabriela (vedoucí práce) ; Beranová, Jana (oponent)
Rod Streptomyces produkuje víc jak polovinu známých bioaktivních látek, čímž se řadí mezi významné bakteriální rody. Streptomyces lincolnensis ATCC 25466 ve svém genomu obsahuje biosyntetický genový klastr pro biosyntézu linkomycinu. Vedle biosyntetických a regulačních genů klastr obsahuje také tři rezistenční geny, lmr(A), lmr(B) a lmr(C), u kterých se předpokládá zapojení v ochraně před toxicitou syntetizovaného antibiotika. Protein Lmr(C) patří mezi ARE proteiny obecně udílející rezistenci ke klinicky důležitým třídám antibiotik: makrolidům, streptograminům, linkosamidům a pleuromutilinům. ARE proteiny jsou vedle producentů těchto antibiotik přítomny také u patogenních mikroorganismů. Přesto mechanismus rezistence udílený těmito proteiny, které sice spadají mezi ABC transportéry, ale na rozdíl od nich postrádají transmembránovou doménu, není charakterizován. Tím se ARE proteiny stávají zajímavým předmětem výzkumu. Prostřednictvím delečních mutant v rezistenčních genech lmr(A), lmr(B) a lmr(C) jsme zjišťovali vliv těchto genů na produkci linkomycinu a rezistenci k linkosamidům, linkomycinu a klindamycinu, a to se zvláštním zřetelem na funkci lmr(C). Zjistili jsme, že delece genu lmr(C) zásadně neovlivňuje produkci a ani rezistenci k linkomycinu, avšak má výrazný vliv na rezistenci ke...
|
|
|
Vliv exprese vanZTei a vanZg na rezistenci ke glykopeptidovým antibiotikům u Staphylococcus aureus
Zieglerová, Leona ; Balíková Novotná, Gabriela (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent)
Membránový protein VanZTei, který je kódován genem vanZ z vanA glykopeptidového rezistenčního genového klastru je součástí velké rodiny VanZ proteinů. VanZTei udílí rezistenci k teikoplaninu u Enterococcus faecalis a to nezávisle na přítomnosti dalších proteinů kódovaných klastrem. Náplní práce bylo porovnat schopnost dvou ortologních proteinů VanZTei a VanZg (z genomické DNA Enterococcus faecium) udílet rezistenci ke glykopeptidům u Staphylococcus aureus RN4220 a u Enterococcus faecium. Bylo zjištěno, že VanZg 8-16 krát zvyšuje rezistenci k teikoplaninu (Tei) a udílí 8 krát větší rezistenci k dalbavancinu (Dalb). VanZTei také udílí rezistenci k Tei i Dalb, ale zvýšení rezistence je jen dvojnásobné. Naopak VanZTei udílí v porovnání s VanZg účinněji rezistenci k nově syntetizovaným glykopeptidovým antibiotikům (čtyřnásobné zvýšení rezistence pro VanZTei a 2-4 násobné zvýšení rezistence pro VanZg). To naznačuje, že oba proteiny mají rozdílnou specificitu k antibiotikům. Přesto byly vyselektovány mutanty S. aureus RN4220 VanZTei pRMC2 se zvýšenou rezistencí k teikoplaninu (MICTei > 8 µg/ml) u nichž je rezistence závislá na expresi vanZTei. Tyto rezistentní mutanty nenesou mutaci v genu vanZTei ani v jeho ribozomálním vazebném místě. Ani jeden z proteinů neudílí rezistenci k vankomycinu a k jiným...
|
|
|
The effect of aminoacid variability on the resistance phenotype in ARE subfamily of ABC proteins
Lenart, Jakub ; Balíková Novotná, Gabriela (vedoucí práce) ; Fišer, Radovan (oponent)
ARE podrodina proteinů patřící k ABC transportérům uděluje v různé míře rezistenci k makrolidovým, linkozamidovým a streptograminovým antibiotikům. Mezi klinicky nejvýznamnější proteiny ARE podrodiny u stafylokoků patří Vga(A) protein udílející rezistenci ke streptogtraminům A. V roce 2006 byla objevena jeho nová varianta označována jako Vga(A)LC, která kromě streptograminů A uděluje také rezistenci k linkosamidům. Vga(A) a Vga(A)LC se liší pouze v 7 aminokyselinách, přesto udílejí odlišný rezistenční fenotyp. V předchozích experimentech bylo zjištěno, že centrální roli v určení substrátové specificity hrají 4 aminokyselinové rozdíly, které jsou nahloučené v úseku 15 aminokyselin uvnitř linkeru spojující dvě ABC domény (pozice 212, 219, 220 a 226). Kombinace aminokyselin LGAG z Vga(A) zvyšuje rezistenci k streptogramínům A, zatímco kombinace SVTS přítomná ve Vga(A)LC zvyšuje rezistenci k linkosamidům. Přestože do této podrodiny patří velké množství rezistenčních proteinů, mechanismus rezistence nebyl dosud s jistotou prokázán. Cílem práce bylo vytvoření nových Vga(A) variant, které obsahují kombinace aminokyselin specifických pro Vga(A) a Vga(A)LC protein v pozicích 212, 219, 220 a 226 a porovnání jejich schopnosti udeľovať rezistenci k linkosamidům. Také jsme zkoumali vliv mutací v téže variabilní části...
|
|
|
Rezistence k antibiotikům udílená proteiny ARE podrodiny ABC proteinů
Veselá, Ludmila ; Balíková Novotná, Gabriela (vedoucí práce) ; Borčin, Kateřina (oponent)
Hlavním tématem této práce je ARE podrodina ABC transportérů. Důležitost proteinů této podrodiny spočívá v tom, že udělují rezistenci k několika skupinám klinicky důležitých antibiotik: makrolidům, linkosamidům, streptograminům a pleuromutilinům a to u významných patogenů jakým je např. Staphylococcus aureus. Na rozdíl od klasických ABC transportérů struktura ARE proteinů postrádá transmembránovou doménu (TMD) a prozatím nebyl nalezen ani interagující transmembránový protein. Z toho důvodu není jasný mechanismus udílení rezistence. V práci diskutujeme obě navrhované hypotézy mechanismu funkce těchto proteinů. První je aktivní efflux antibiotika ven z bakterie. Druhá hypotéza spočívá v uvolnění antibiotika z jeho vazebného místa, které je iniciované ARE proteiny, a jeho následná pasivní difuse ven z buňky. Klíčová slova: ABC proteiny, ARE proteiny, rezistence, MLS, Vga
|
host ::
RSS.